パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価
Summary
3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere 特性評価できます。
Abstract
神経膠腫におけるタンパク質発現の解析、その病理学の研究ではいくつかの側面に関連しています。多くの蛋白質は、バイオ マーカー、診断、予後、分類、腫瘍の進行の状態や細胞分化状態のアプリケーションとして記載されています。これらのバイオ マーカーの分析また神経膠腫患者および神経膠腫モデルから生成された腫瘍細胞 (NS) の特性評価に便利です。腫瘍の NS は、そこから派生し、ミラー神経膠腫の生物学をすることができますより正確に腫瘍のさまざまな機能を評価するために貴重な生体外モデルを提供します。腫瘍 NS のバイオ マーカーを分析する詳細な方法について述べるここ NS パラフィン埋め込まれた腫瘍の免疫組織染色 (IHC) を使用します。
Introduction
神経膠腫は、プライマリ1世界保健機関によると彼らの表現型と遺伝子型の特性によって分類される中枢神経系腫瘍です。この分類には、バイオ2の魅力的なソースを表すドライバー変異の有無が組み込まれています。バイオ マーカーは、生物学的特性、測定および薬理学的治療的介入3レスポンスと同様、正常および病的プロセスを示す評価することができます。バイオ マーカーを検出することができます腫瘍、神経膠腫由来細胞のさまざまな側面での生物学的特性を有効にします。神経膠腫のバイオ マーカーなどが変異イソクエン酸脱水素酵素 1 (IDH1) 変異体酵素より良い予後4に関連付けられている低学年の神経膠腫の特徴です。変異 IDH1 TP53 と α サラセミア ・精神遅滞症候群 X リンク (ATRX) との組み合わせで発現される-4,5サブタイプの特定神経膠腫を定義する変異を不活化します。ATRX 不活性化突然変異はまた小児の悪性グリオーマ2,6の 44% で発生し、積極的な腫瘍とゲノム不安定性6,7に関連付けられています。さらに、組み込み小児びまん性橋グリオーマ (DIPG) は、ヒストン H3 遺伝子 H3F3A、または HIST1H3B/C 遺伝子1,6K27M 突然変異の有無によるとサブグループで区別されます。したがって、分子特性の導入により細分化、研究、およびより多くの開発を使用すると、別のエンティティとして神経膠腫の治療標的療法各サブタイプ。8アポトーシス、オートファジー9、細胞周期進行10、細胞増殖11、細胞分化12 などの別の生物学的過程を評価するバイオ マーカーの解析を使用ことができますさらに、.
人間のがんに遺伝的病変を抱く遺伝子組み換えの動物モデルは、病気の進行を仲介するシグナリングパスの研究のために重要です。当研究室は、ひと神経膠腫サブタイプ13,14を要約するだろう特定の突然変異をかくまっている神経膠腫の遺伝子組み換えマウス ・ モデルを開発する睡眠美容 (SB) トランスポザーゼ システムの使用を実装しています。これらの遺伝子改変マウスのモデルは、腫瘍由来の NS は、3 D システムでの in vitro研究を有効にするを生成するため使用され、腫瘍原15でミラーリングの顕著な特徴を提示します。また、マウスに NS の orthotopical 移植は、原発腫瘍の機能を保持し、対応する原発15の病理組織学的、ゲノム、および表現型特性を模倣する二次性腫瘍を生成できます。
無血清培養幹細胞性脳腫瘍細胞を濃縮することができますと表皮の成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) の存在下で彼らは、NS 文化などの単一細胞由来植民地として成長できます。この選択的培養システムでほとんど差別化や差別化された細胞急速には死ぬ、幹細胞は分割し、細胞集塊を形成するのに対し。これは、神経膠腫腫瘍機能16,17,18を保持する NS 文化の生成可能です。神経膠腫の NS は、腫瘍生物学、バイオ マーカー、診断、予後、分類、腫瘍の進行の状態や細胞分化状態にアプリケーションの分析を含むいくつかの側面を評価する使用できます。ここでは、我々 の神経膠腫 NS を生成し、3 D の文化に使用されるパラフィン埋め込むプロトコル詳細 IHC 染色。修正とグリオーマ NS を埋め込みの利点の 1 つは NS の形態が、従来 cytospin 法19の神経膠腫で NS 細胞解離の操作をストレスにさらされ、扁平になると比較してより良いが維持されます。さらに、遺伝子組み換え腫瘍蛍光スペクトルにわたって染色の有効化、NS から内因性蛍光式を消光を埋め込みます。このメソッドの全体的な目標は、プロセスを埋め込むパラフィンによる神経膠腫細胞の 3 D 構造を維持し、免疫組織染色による神経膠腫細胞の特性です。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事で詳細に説明してパラフィン埋め込まれた神経膠腫、NS で免疫組織化学を実行する汎用性と再現性のある方法脳原で成長している腫瘍細胞の特性の 3 D 構造を維持します。この手法は、ガラスやプラスチック表面にメッキのセルを使用して次の利点を所有している: 私) NS; の 3 D 構造の保全ii) 蛋白質の表現の分析前に細胞解離のストレスの回避iii) 遺伝子組み換え腫瘍蛍光スペ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、M.G.C.; に R21 NS091555 R01 NS074387 ・ ストローク (NIH/NINDS) 助成金 R37-NS094804 国立健康/国立研究所の神経疾患に支えられNIH/NINDS 付与 R01 NS076991、R01-NS082311、および R01 NS096756 P.R.L.;NIH/NINDS R01-EB022563;1UO1CA224160;脳神経科リアの M.G.C. と P.R.L.; 幸せな心RNA 生物医学助成金 F046166 M.G.C. F.M.M. にはサポートによって、F31 NIH/NINDS-F31NS103500。J. p. は、フルブライト アルゼンチン スポーツ省と教育フェローシップによって支持されました。
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
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