Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
Summary
Ici, un protocole est présenté pour produire et élever des poissons électriques KNOCKOUT génome CRISPR/Cas9. Les exigences requises en matière de biologie moléculaire, de reproduction et d’élevage pour un gymnotiforme et un mormyride, ainsi que les techniques d’injection pour produire des larves d’indel F0 induites par Cas9 sont décrites en détail.
Abstract
L’électroréception et l’électrogenèse ont changé dans l’histoire évolutive des vertébrés. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune. C’est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléostriche d’espèces qui produisent et détectent les champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Au cours des 50 années qui se sont écoulés depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l’électricité pour sentir leur environnement et communiquer, une communauté croissante de scientifiques a acquis d’énormes connaissances sur l’évolution du développement, des systèmes et des circuits de neurosciences, physiologie cellulaire, l’écologie, la biologie évolutive et le comportement. Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques pour le poisson électrique. L’utilisation de ces ressources a déjà facilité d’importantes connaissances en ce qui concerne le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces. Un obstacle majeur à l’intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d’outils de génomique fonctionnelle. Nous rapportons ici un protocole complet pour effectuer la mutagénèse DE CRISPR/Cas9 qui utilise des mécanismes endogènes de réparation d’ADN dans les poissons faiblement électriques. Nous démontrons que ce protocole est également efficace dans les deux espèces mormyrides Brienomyrus brachyistius et le brachyhypopomus gauderio gymnotiforme en utilisant CRISPR/Cas9 pour cibler des indels et des mutations ponctuelles dans le premier exon de la gène du canal de sodium scn4aa. À l’aide de ce protocole, des embryons des deux espèces ont été obtenus et génotypes pour confirmer que les mutations prédites dans le premier exon du canal de sodium scn4aa étaient présentes. Le phénotype de succès knock-out a été confirmé avec des enregistrements montrant des amplitudes réduites de décharge électrique d’organe comparées aux contrôles non injectés de taille-assortis.
Introduction
L’électroréception et l’électrogenèse ont changé dans l’histoire évolutive des vertébrés. Deux lignées de poissons teleost, ostéoglossiformes et siluriformes, électroréception évoluée en parallèle, et cinq lignées de teleosts (gymnotiformes, mormyrides, et les genres Astroscopus, Malapterurus, et Synodontis) l’électrogenèse évoluée en parallèle. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune1,2,3.
C’est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléost, riches en espèces, qui produisent et détectent des champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Dans les 50 ans depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l’électricité pour sentir leur environnement et de communiquer4, une communauté croissante de scientifiques a acquis des connaissances énormes dans l’évolution du développement1,5 ,6, systèmes et circuitsneurosciences 7,8,9,10, physiologie cellulaire11,12, écologie et énergie13 ,14,15,16,17, comportement18,19, et macroévolution3,20,21 .
Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques, transcriptomiques et protéomiques pour les poissons électriques1,22,23,24,25,26, 27,28. L’utilisation de ces ressources a déjà produit des informations importantes sur le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces1,2,3,28,29 ,30. Un obstacle majeur à l’intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d’outils de génomique fonctionnelle31.
L’un de ces outils est la technique récemment développée clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats jumelée à la technique de l’endoucase Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 est un outil d’édition du génome qui est entré dans une utilisation généralisée dans les deux modèles32,33,34 et les organismes non-modèles35,36,37 de même. La technologie CRISPR/Cas9 a progressé à un point tel qu’un laboratoire capable de biologie moléculaire de base peut facilement générer des sondes spécifiques aux gènes appelées ARN à guide court (sgARN), à faible coût en utilisant une méthode de non-clonage38. CRISPR a des avantages par rapport à d’autres stratégies knock/knockdown, telles que les morpholinos39,40, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs), et les nucléases de doigts de zinc (ZNNs), qui sont coûteuses et temps à générer pour chaque gène cible.
Le système CRISPR/Cas9 fonctionne pour créer des kogènes en ciblant une région spécifique du génome, dirigée par la séquence sgRNA, et en provoquant une rupture à double brin. La rupture à double brin est détectée par la cellule et déclenche des mécanismes de réparation de l’ADN endogène de préférence en utilisant la voie de jointure non-homologue (NHEJ). Cette voie est très sujette aux erreurs : pendant le processus de réparation, la molécule d’ADN incorporera souvent des insertions ou des suppressions (indels) sur le site de rupture à double brin. Ces indels peuvent entraîner une perte de fonction due soit à (1) des changements dans le cadre de lecture ouverte, (2) l’insertion d’un codon d’arrêt prématuré, ou (3) des changements dans la structure primaire critique du produit génique. Dans ce protocole, nous utilisons l’édition CRISPR/Cas9 pour cibler les mutations ponctuelles dans les gènes cibles à l’aide du NHEJ chez les espèces de poissons faiblement électriques. Bien que plus simple et plus efficace que d’autres techniques, cette méthode de mutagénèse devrait se traduire par une gamme de séquilosités phénotypiques en F0, qui est attribuée au mosaïsme génétique41,42,43 ,44.
Sélection d’organismes
Afin de faciliter les études futures sur la génomique comparative des poissons faiblement électriques, une espèce représentative des gymnotiformes et des mormyrides pour le développement du protocole devait être sélectionnée. À la suite des discussions qui ont eu lieu lors de la réunion 2016 sur les poissons électriques à Montevideo, en Uruguay, il y a eu consensus communautaire pour utiliser des espèces qui pouvaient déjà être élevées en laboratoire et qui disposaient de ressources génomiques. Le gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio et le mormyrid Brienomyrus brachyistius ont été sélectionnés comme espèces qui correspondent à ces critères. Chez les deux espèces, les indices naturels pour induire et maintenir les conditions de reproduction sont faciles à imiter en captivité. B. gauderio, une espèce de gymnotiforme d’Amérique du Sud, a l’avantage de faibles exigences d’élevage : les poissons peuvent être maintenus à densité relativement élevée dans des réservoirs relativement petits (4 L). B. gauderio a également un chiffre d’affaires générationnel rapide dans des conditionscaptives. Dans des conditions de laboratoire, B. gauderio peut se développer de l’œuf à l’adulte en environ 4 mois.
B. brachyistius, une espèce de poisson mormyride d’Afrique centrale de l’Ouest, se reproduit facilement en captivité. B. brachyistius est facilement disponible dans le commerce de l’aquarium, a été largement utilisé dans de nombreuses études, et dispose maintenant d’un certain nombre de ressources génomiques disponibles. Leur cycle de vie s’étend sur 1 à 3 ans, selon les conditions de laboratoire. Les exigences en matière d’élevage sont un peu plus intenses pour cette espèce, ce qui nécessite des réservoirs de taille moyenne (50 à 100 L) en raison de leur agressivité pendant la reproduction.
Les laboratoires qui étudient d’autres espèces de poissons électriques devraient être en mesure d’adapter facilement ce protocole tant que l’espèce peut être élevée, et que les embryons à cellule unique peuvent être recueillis et élevés à l’âge adulte. Les taux de logement, d’élevage larvaire et de fécondation in vitro (FIV) changeront probablement avec d’autres espèces; cependant, ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour les tentatives de reproduction chez d’autres poissons faiblement électriques.
Une cible génétique idéale pour la preuve de concept: scn4aa
Les poissons mormyrides et gymnotiformes faiblement électriques génèrent des champs électriques (électrogenèse) en déchargeant un organe spécialisé, appelé l’orgue électrique. Les décharges d’organes électriques (EOD) résultent de la production simultanée de potentiels d’action dans les cellules d’organes électriques appelées électrocytes. Les EOD sont détectés par un éventail d’électrorécepteurs dans la peau pour créer des images électriques à haute résolution de l’environnement du poisson45. Les poissons faiblement électriques sont également capables de détecter les caractéristiques des formes d’onde EOD18 de leurs conspécifiques ainsi que leurs taux de décharge46, permettant aux EOD de fonctionner en plus comme un signal de communication sociale analogue au chant des oiseaux ou à la grenouille vocalisations47.
Un composant principal de la génération potentielle d’action dans les électrocytes des poissons faiblement électriques mormyrid et gymnotiform est le canal de sodium tension-fermé NaV1.42. Les teleosts non-électriques expriment deux copies de gène paralogous, scn4aa et scn4ab,codage pour le canal de sodium à la tension NaV1.430. Dans les lignées de poissons à la fois gymnotiformes et mormyrides faiblement électriques, scn4aa a évolué rapidement et a subi de nombreuses substitutions d’acides aminés qui affectent ses propriétés cinétiques48. Plus important encore, scn4aa est devenu compartimenté dans les deux lignées à l’orgue électrique2,3. L’expression relativement limitée de scn4aa à l’orgue électrique, ainsi que son rôle clé dans la génération d’EODs, en fait une cible idéale pour les expériences PAR KO CRISPR/Cas9, car il a des effets pléiotropes délétères minimes. Étant donné que les poissons faiblement électriques commencent à décharger leurs organes électriques larvaires 6 à 8 jours après la fécondation (DPF), le ciblage du scn4aa est idéal pour le phénotypage rapide après la microinjection d’embryons.
Protocol
Representative Results
Discussion
La richesse phénotypique des poissons faiblement électriques, ainsi qu’une prolifération récente des ressources génomiques, motivent un fort besoin d’outils génomiques fonctionnels dans le modèle de poisson faiblement électrique. Ce système est particulièrement attrayant en raison de l’évolution convergente de nombreux traits phénotypiques dans les lignées parallèles de poissons, qui sont facilement conservés en laboratoire.
Le protocole décrit ici démontre l’efficacité de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent les efforts héroïques de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud et Hope Healey pour obtenir de l’aide pour l’élevage des poissons, la collecte de données et le développement précoce du protocole. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs pour leurs suggestions au manuscrit. Nous croyons que le produit final est de meilleure qualité après avoir répondu à leurs commentaires. Ces travaux ont été financés par le soutien de la National Science Foundation #1644965 et #1455405 à JRG, et la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie DG à VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
- Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
- Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
- Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
- Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
- Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
- Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
- Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
- Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
- Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
- Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
- Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
- Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
- Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
- Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
- Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
- Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
- Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
- Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
- Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
- Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
- Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
- Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
- Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
- Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
- Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
- Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
- Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
- Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
- Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. 发育生物学. 445 (2), 156-162 (2019).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 发育生物学. 393 (1), 3-9 (2014).
- Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. 遗传学. 199 (1), 1-15 (2015).
- Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
- van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
- Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
- Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
- Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
- Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
- Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
- Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
- Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
