火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集
Summary
ここでは、CRISPR/Cas9ゲノムノックアウト電気魚を製造し、後部するためのプロトコルが提示される。詳細に概説するのは、ジムノチフォームとモルミリドの両方に必要な分子生物学、繁殖、および夫の要件、およびCas9誘発インデルF0幼虫を産生するための注射技術である。
Abstract
電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。共通の遺伝的構造を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。これはおそらく、ジムノチフォームとモルミリドの数多くの収束的な特徴、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれる2種豊富なテレオストクレードによって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、コミュニケーションをとっているという発見から50年の間に、科学者のコミュニティは、開発、システム、回路神経科学の進化に関する大きな洞察を得てきました。細胞生理学、生態学、進化生物学、行動最近では、電気魚のゲノム資源が急増しています。これらの資源の使用は、これらの種における遺伝子型と表現型との関連に関する重要な洞察を既に促進している。弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的なゲノムツールの欠けている現在の欠如である。ここでは、弱い電気魚の内因性DNA修復機構を利用したCRISPR/Cas9突然変異誘発を行うための完全なプロトコルを報告する。我々は、このプロトコルが、CRISPR/Cas9を使用して、最初のエキソンにおけるインデルと点突然変異を標的とすることにより、モルミリ種ブリジノミルス・ブラキシシステウスとジムノチフォーム・ブラキポポムス・ガウデリオの両方で等しく有効であることを実証する。ナトリウムチャネル遺伝子scn4aa.このプロトコルを用いて、両方の種から胚を得て、ナトリウムチャネルscn4aaの最初のエキソンに予測された突然変異が存在することを確認するために遺伝子型化された。ノックアウト成功表現型は、未注入のサイズ一致制御と比較した場合、電気器官放電振幅の低下を示す記録で確認された。
Introduction
電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。テレオスト魚の2つの系統、骨グロシ目とシルリフォーム、並行してエレクトロレセプションを進化させ、テレオスト(ジムノチフォルム、モルミリド、および系統アストロズコプス、マラプテルス、シノドンティス)の5つの系統並行して進化した電気発生。共通の遺伝的アーキテクチャを共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。
これはおそらく、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれるジムノチフォームとモルミリド、2種豊富なテレオストクレードの数多くの収束的な特徴によって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、通信する4を発見してから50年の間に、科学者のコミュニティは開発1、5の進化に関する大きな洞察を得ています。 ,6, システム及び回路 神経科学7,8,9,10, 細胞生理学11,12, 生態学とエネルギー13,14,15,16,17, 動作18,19, マクロエボリューション3,20,21.
最近では、電気魚1、22、23、24、25、26のゲノム、転写、およびプロテオミクス資源の増殖が起きており、 27、28.これらの資源の使用は、これらの種1、2、3、28、29における遺伝子型と表現型の関係に関する重要な洞察を既に生み出している 、30.弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的ゲノムツール31の現在の欠如である。
そのようなツールの1つは、最近開発されたクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロミックリピートとCas9エンドヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9、CRISPR)技術です。CRISPR/Cas9は、モデル32、33、34および非モデル生物35、36、37の両方で広く使用されているゲノム編集ツールである。CRISPR/Cas9技術は、基礎分子生物学が可能な実験室が、非クローニング法38を用いて低コストで、ショートガイドRNA(sgRNA)と呼ばれる遺伝子特異的プローブを容易に生成できるところまで進歩した。CRISPRは、モルフォリノス39、40、転写活性化剤様エフェクタヌクレアーゼ(TALENs)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFC)などの他のノックアウト/ノックダウン戦略よりも優れている。すべての標的遺伝子の生成に時間がかかります。
CRISPR/Cas9システムは、sgRNA配列によって指示されるゲノムの特定の領域を標的とし、二本鎖の破壊を引き起こすことによって遺伝子ノックアウトを作成するために機能する。二本鎖の破断は細胞によって検出され、非相同末端結合(NHEJ)経路を用いて優先的に内因性DNA修復機構を引き起こす。この経路は非常に誤差が起こりやすい:修復プロセス中に、DNA分子はしばしば二本鎖破壊部位に挿入または欠失(インデル)を組み込む。これらのインデルは、(1)オープンリーディングフレームのシフト、(2)早期停止コドンの挿入、または(3)遺伝子産物の重要な一次構造のシフトのいずれかによる機能の喪失をもたらす可能性がある。このプロトコルでは、CRISPR/Cas9編集を利用して、弱い電気魚種のNHEJを用いた標的遺伝子の標的点突然変異を標的とする。他の技術よりもシンプルで効率的であるが、この突然変異誘発の方法は、遺伝的モザイク41、42、43に起因するF0における一帯のフェチピックの重症度をもたらすことが期待される。,44.
生物の選択
弱い電気魚の比較ゲノムに関する将来の研究を促進するために、プロトコル開発のためのジムノチフォームとモルミリドの両方の代表的な種を選択する必要がありました。ウルグアイのモンテビデオで開催された2016年の電気魚会議での議論の後、すでに実験室で飼育でき、ゲノム資源を利用できる種を利用するコミュニティコンセンサスがありました。ジムノチフォルム・ブラキポポムス・ガウデリオとモルミリド・ブリエンミロス・ブラキシシウスは、これらの基準に適合する種として選ばれた。両方の種で、繁殖状態を誘導し、維持するための自然の手掛かりは、捕虜を模倣することが容易です。B.ガウデリオは、南米のジムノチフォーム種であり、低い夫の要件の利点を有する:魚は比較的小さな(4 L)タンクで比較的高密度に保つことができる。B.ガウデリオはまた、捕虜の条件下で速い世代のターンオーバーを持っています.実験室の条件下では、B.ガウデリオは約4ヶ月で卵から成人に発達する可能性があります。
西中央アフリカのモルミリド魚の一種であるB.ブラキシシウスは、捕虜の中で容易に繁殖する。B.ブラキシウスは、水族館の貿易を通じて容易に入手可能であり、多くの研究で広く使用されており、現在、利用可能なゲノム資源の数を持っています。彼らのライフサイクルは、実験室の条件に応じて、1-3年に及びます。夫の要件は、繁殖中の攻撃性のために適度なサイズのタンク(50-100 L)を必要とし、この種のためにやや集中的です。
他の種の電気魚を研究する実験室は、種が繁殖できる限りこのプロトコルを容易に適応させることができるはずであり、単一細胞胚を収集し、成人期に飼育することができる。住宅、幼虫の夫、および体外受精(IVF)率は、他の種と変わる可能性があります。しかし、このプロトコルは、他の弱い電気魚の繁殖の試みの出発点として使用することができます。
概念実証のための理想的な遺伝子標的:scn4aa
弱い電気モルミリドとジムノチフォーム魚は、電気器官と呼ばれる特殊な臓器を排出することによって電界(電解)を発生させる。電気器官放電(EOD)は、エレクトロサイトと呼ばれる電気器官細胞における作用電位の同時産生から生じる。EIDは、魚の周囲の高解像度の電気画像を作成するために皮膚内の電気受容体の配列によって検出される45。弱い電気魚はまた、彼らのコンコンフェリングのEOD波形18だけでなく、その排出速度46の特徴を検出することができ、EODは鳥の歌やカエルに類似した社会的コミュニケーション信号としてさらに機能することができます発声47.
モルミリドとジムノチフォームの両方の電気細胞における作用電位発生の主な構成要素は、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.42である。非電気テレオストは、2つのパラロゴス遺伝子コピーを発現し、scn4aaおよびscn4abは、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.430に対するコーディングを行う。ジムノチフォームとモルミリドの両方の弱い電気魚系統において、scn4aaは急速に進化し、その運動特性に影響を与える多数のアミノ酸置換を受けている48.最も重要なことは、scn4aaは電気器官2、3への両方の系統で区画化されている。電気器官に対するscn4aaの比較的制限された発現と、EOFの生成における重要な役割は、有害な多発性効果を最小限に抑えるため、CRISPR/Cas9ノックアウト実験の理想的なターゲットとなります。弱い電気魚は幼虫電気器官を6-8日後に放出し始めるので、scn4aaのターゲティングは胚マイクロインジェクション後の迅速なフェノタイピングに理想的に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
弱い電気魚のフェノチピックな豊かさは、最近のゲノム資源の急増と共に、弱い電気魚モデルにおける機能的ゲノムツールの強い必要性を動機づけている。このシステムは実験室で容易に保たれる魚の並行系統の多数の形質形質の収束の進化のために特に魅力的である。
ここで説明するプロトコルは、電気発生と電気受信を並行して進化させた弱い電気魚の系統におけ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、モニカ・ルーカス、キャサリン・ショー、ライアン・テイラー、ジャレッド・トンプソン、ニコール・ロビショー、ホープ・ヒーリーの英雄的な努力を認め、魚の夫、データ収集、初期のプロトコル開発に協力してくれた。また、3人の審査員の原稿に対するご提案に感謝申し上げたいと思います。私たちは、彼らのコメントに対処した後、最終的な製品は、より良い品質であると信じています。この研究は、国立科学財団#1644965#1455405からJRGへの支援を受け、自然科学・工学研究協議会のVLSへの助成金を受けています。
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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