JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Published: October 27, 2019
doi:
10.3791/60253
, , , ,
1Department of Integrative Biology,Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes,Humboldt University, 3Department of Biology,Cape Breton University

Summary

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

Abstract

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת. זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של צורות הג ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades כי לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז התגלית כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות להתפתחות של פיתוח, מערכות ומעגלים מדעי המוח, פיזיולוגיה של הסלולר, אקולוגיה, ביולוגיה אבולוציונית והתנהגות. לאחרונה, יש התפשטות של משאבים גנומית עבור דגים חשמליים. השימוש במשאבים אלה כבר הנחה תובנות חשובות לגבי הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפים במינים אלה. מכשול גדול לשילוב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטים של דגים חשמליים חלש הוא העדר הנוכחי של כלי גנומיקה תפקודית. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מלא לביצוע CRISPR/Cas9 מוטגנזה אשר מנצל מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים בדגים חשמליים חלש. אנו מדגימים כי פרוטוקול זה הוא יעיל באותה מידה הן מיני מורגמיל ברינורוס ברכימיטיוס ואת הטופס המסוןברכימוטציות gauderio באמצעות Crispr/Cas9 כדי למקד את indels ואת הנקודה המוטציות באקסון הראשון של ערוץ הנתרן גן scn4aa. באמצעות פרוטוקול זה, עוברים משני המינים הושגו והוקלדה על מנת לאשר כי המוטציות החזוי ב הראשון של ערוץ הנתרן scn4aa היו נוכחים. הצלחת להוריד את ההצלחה פנוטיפ היה אישר עם הקלטות מראה מופחת החוצה איבר חשמלי הפחתת המוני כאשר לעומת שולטת בגודל לא מוזרק התאמה.

Introduction

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. שני מדורות של דגי teleost, אוסטוריאים וסילאואים, התפתחו התפשלות חשמלית במקביל, וחמש שנות שילוח (ממוראים, מוררידים, וכללי אסטרוסקופוס, מאלאפטראורוס וסינודונטיס) התפתחו אלקטרוגנזה במקביל. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת1,2,3.

זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של טפסי ממורשים ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades, אשר לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז גילוי כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר4, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות לתוך האבולוציה של פיתוח1,5 ,6, מערכות ומעגלים מדעי המוח7,8,9,10, פיזיולוגיה הסלולר11,12, אקולוגיה ו energetics13 ,14,15,16,17, התנהגות18,19, ומאקרואבולוציה3,20,21 .

לאחרונה, יש התפשטות של גנומית, טראנסקריפט, ו פרוטאומית משאבים עבור דגים חשמליים1,22,23,24,25,26, 27,28. השימוש במשאבים אלה כבר הפיק תובנות חשובות בנוגע לקשר בין גנוטיפ לפנוטיפ במינים אלה1,2,3,28,29 ,30. מכשול גדול כדי לשלב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטימית של דגים חשמליים חלש הוא חוסר הנוכחי של כלים גנומיקה תפקודית31.

אחד כלי כזה הוא שפותחה לאחרונה באשכולות באופן קבוע במרווחים של Palindromic קצר לזווג עם Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) טכניקה. Crispr/Cas9 הוא כלי עריכת הגנום כי נכנס לשימוש נרחב בשני דגם32,33,34 ו אורגניזמיםשאינם מודל 35,36, 37 כאחד . CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה מעבדה המסוגלת ביולוגיה מולקולרית בסיסי יכול בקלות ליצור גנים ספציפיים המכונה RNAs מדריך קצר (sgRNAs), בעלות נמוכה באמצעות שיטה שאינה שיבוט38. Crispr יש יתרונות על אחרים הסתרה/מיקוד אסטרטגיות, כגון activator olinos39,40, תמלול שעתוק כמו הנוקלאוסים (talens), ו אבץ האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), אשר יקרים ו זמן רב להפיק. עבור כל גן מטרה

מערכת CRISPR/Cas9 פונקציות כדי ליצור הסתרה גנים על ידי התמקדות באזור ספציפי של הגנום, בבימויו של רצף sgRNA, וגרימת הפסקה כפולה תקוע. הפסקה כפולה נתקע מזוהה על ידי התא ומפעילה מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים המועדפת באמצעות הסוף הלא הומוולוגי להצטרף (NHEJ) המסלול. מסלול זה הוא מאוד מועדת לטעויות: במהלך תהליך התיקון, מולקולת ה-DNA כוללים לעתים קרובות הוספות או מחיקות (indels) באתר הפריצה כפול תקוע. Indels אלה יכולים לגרום לאובדן של הפונקציה בשל אחד (1) משמרות במסגרת הקריאה הפתוחה, (2) החדרת codon עצירה מוקדמת, או (3) משמרות במבנה העיקרי הקריטי של המוצר הגן. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים CRISPR/Cas9 עריכה כדי מוטציות נקודת היעד בגנים היעד באמצעות NHEJ ב מינים של דגים חשמליים חלש. בעוד ששיטה זו פשוטה ויעילה יותר מטכניקות אחרות, צפויה שיטה זו של מוטגנזה לגרום למגוון של התסופנותולים ב-F0, המיוחס לפסיפס גנטי41,42,43 ,44

מבחר של אורגניזמים
לצורך הקלה על מחקרים עתידיים על הגנומיקה השוואתית של דג חשמלי חלש, מינים מייצגים עבור הטפסים ומורמירידים לפיתוח פרוטוקולים הדרושים כדי להיבחר. בעקבות דיונים במהלך הפגישה 2016 דג חשמלי במונטווידאו, אורוגוואי, היה קונצנזוס הקהילה לנצל מינים שכבר יכול להיות מתרבה במעבדה, כי היו משאבים גנומית זמין. והמורמיטיוס של ברימאסיוס . נבחרו כמינים המתאימים לקריטריונים הללו… בשני המינים, רמזים טבעיים כדי לגרום ולשמור על תנאי הרבייה קל לחקות בשבי. ב. gauderio, מינים בצורת מיני מדרום אמריקה, יש את היתרון של דרישות גידול נמוכות: ניתן לשמור על הדגים בצפיפות גבוהה יחסית בטנקים קטנים יחסית (4 ל). ב. gauderio גם יש מחזור דורי מהיר בתנאים שבויים. בתנאי מעבדה, B. gauderio יכול להתפתח ביצה למבוגר בתוך כ 4 חודשים.

ב. ברכסיטיוס, זן של דג מורמי ממערב אפריקה, מוליד בקלות בשבי. ב. ברכסיטיוס הוא זמין באמצעות הסחר באקווריום, נעשה שימוש נרחב במחקרים רבים, וכעת יש מספר משאבים גנומית זמין. מחזור חייהם משתרע על פני 1-3 שנים, תלוי בתנאי מעבדה. דרישות הגידול מאינטנסיביות מעט יותר עבור מין זה, הדורשות מיכלים בגודל בינוני (50 ל-100 ליטר) בשל התוקפנות שלהם במהלך הרבייה.

מעבדות לימוד מינים אחרים של דגים חשמליים צריך להיות מסוגל להתאים בקלות את הפרוטוקול הזה כל עוד המינים יכולים להיות מתרבה, ועוברי תא בודד ניתן לאסוף והתרומם לתוך בבגרות. הדיור, גידול הזחל, ו הפריה חוץ גופית (IVF) התעריפים עשויים להשתנות עם מינים אחרים; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה עבור ניסיונות רבייה של דגים חשמליים חלש אחרים.

יעד הגן האידיאלי עבור הוכחת המושג: scn4aa
מורגמיל חשמלי חלש ודגים מיוחדים יוצרים שדות חשמליים (אלקטרוגנזה) על ידי הפעלת איבר מיוחד, שנקרא עוגב חשמלי. מקלעת לאיברים חשמליים (EODs) נובעת מייצור סימולטני של פוטנציאל פעולה בתאי איבר חשמלי הנקרא אלקטרוציטים. EODs מזוהים על ידי מערך של אלקטורים חשמליים בעור כדי ליצור תמונות חשמל ברזולוציה גבוהה של הסביבה של הדג45. דגים חשמליים חלש הם גם מסוגלים לזהות תכונות של הפרטים שלהם ‘ EOD גל טפסים18 , כמו גם את שיעורי השחרור שלהם46, המאפשר eod לתפקד בנוסף כאות תקשורת חברתית האנלוגית לשיר ציפורים או צפרדע ברירתמ47.

המרכיב העיקרי של הדור הפוטנציאלי לפעולה באלקטרוציטים של מורגמיל הן והוא בצורה מאוד לא ברור דגים חשמליים חלש הוא ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.42. טלאוסטים שאינם חשמליים מבטאים שני עותקי גנים paralogous, scn4aa ו scn4ab, קידוד עבור ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.430. בשני הצדדים האלה ומורייפטור מפני הscn4aa דגים חשמליים חלש, התפתחו במהירות ועברו החלפות חומצות אמינו רבות המשפיעות על המאפיינים הקינטית שלה48. והכי חשוב, scn4aa הפכה להיות ממדר בשני הצדדים לעוגב חשמלי2,3. הביטוי המוגבל יחסית של scn4aa לאיבר החשמלי, כמו גם התפקיד העיקרי שלה בדור של eods, הופך אותו יעד אידיאלי עבור הניסויים CRISPR/Cas9, כפי שיש לו אפקטים מינימליים מינימלית pleiotropic. בגלל הדגים החשמליים חלש להתחיל לפתוח את הזחל שלהם האיברים החשמליים 6-8 ימים הפריה פוסט (DPF), פילוח של scn4aa הוא אידיאלי מתאים לפנוטיפים מהירים לאחר העובר מיקרוהזרקה.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת מישיגן. 1. בחירת יעדי sgRNA הערה: פרוטוקול מסופק לעיצוב ידני של sgRNAs בשלב 1.1. זה היה מנוצל לבחירת היעד scn4aa . פרוטוקול נוסף מסופק כדי להקל על תהליך זה (שלב 1.2) בא?…

Representative Results

אתרי היעד sgrna זוהו בתוך אקסון 1 של scn4aa בשני ב. gauderio ו -b. ברכסינטיוס כפי שמתואר בסעיף 1. SgRNAs נוצרו כמתואר בסעיף 2. בעקבות בחירה מוצלחת sgRNA וסינתזה (איור 1), במחשוף מבחנה נבדק (איור 2). SgRNAs הפגינו חיתוך מחוץ לכאן נבחרו לאחר מכן עבור מיקרוזריקות תא בודד.</…

Discussion

העושר פנוטילי של דג חשמלי חלש, יחד עם התפשטות האחרונות של משאבי גנומיקה, מניע צורך חזק עבור כלים גנוטים פונקציונלי במודל של דגים חשמליים חלש. מערכת זו היא אטרקטיבית במיוחד בשל האבולוציה מתכנסת של תכונות פנויואיות רבות בתוך ליננים מקבילים של דגים, אשר נשמרים בקלות במעבדה.

הפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים את המאמצים ההרואיים של מוניקה לוקאס, קת’רין שאו, ריאן טיילור, ג’ארד תומפסון, ניקול רוביצ’ד, ותקווה הילי לעזרה עם גידול דגים, איסוף נתונים, ופיתוח פרוטוקולים מוקדם. כמו כן, אנו רוצים להודות לשלושת הבודקים על הצעותיהם לכתב היד. אנו מאמינים שהמוצר הסופי יהיה באיכות טובה יותר לאחר התייחסות לערותיהם. עבודה זו ממומנת על ידי תמיכה של הקרן הלאומית למדע #1644965 ו#1455405 ל-JRG, ואת מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה DG מעניקים VLS.

Materials

20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10X NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. 发育生物学. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 发育生物学. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. 遗传学. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

Tags

CRISPR/Cas9Gene EditingWeakly Electric FishTranscriptomicsGenomicsMicroinjectionZebrafishSpawning AgentSperm CollectionB. GauderioB. Brachyistius

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image