Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.
Abstract
Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Es gibt einen bemerkenswerten Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetische Architektur teilen. Dies wird vielleicht am besten durch die zahlreichen konvergenten Merkmale von Gymnotiformen und Mormyriden veranschaulicht, zwei artenreichen Teleostklades, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und schwach elektrischer Fisch genannt werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität nutzen, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklung, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften gewonnen, Zellphysiologie, Ökologie, Evolutionsbiologie und Verhalten. In jüngerer Zeit hat es eine Vermehrung genomischer Ressourcen für elektrische Fische gegeben. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten ermöglicht. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten schwach elektrischer Fische ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Mutagenese, das endogene DNA-Reparaturmechanismen in schwach elektrischen Fischen nutzt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll sowohl bei der mormyriden Art Brienomyrus brachyistius als auch bei der Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio gleichermaßen wirksam ist, indem wir CRISPR/Cas9 verwenden, um Indels und Punktmutationen im ersten Exon des Natriumkanalgen scn4aa. Mit diesem Protokoll wurden Embryonen beider Arten gewonnen und genotypisiert, um zu bestätigen, dass die vorhergesagten Mutationen im ersten Exon des Natriumkanals Scn4aa vorhanden waren. Der Knock-out-Erfolg-Phänotyp wurde mit Aufnahmen bestätigt, die reduzierte elektrische Organentladungsamplituden im Vergleich zu nicht injizierten größenangepassten Kontrollen zeigten.
Introduction
Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Zwei Linien von Teleostfischen, Osteoglossiformen und Siluriformen, entwickelten parallel den Elektroempfang und fünf Linien von Teleosten (Gymnotiformes, Mormyriden und die Gattungen Astroscopus, Malapterurus und Synodontis) Elektrogenese parallel entwickelt. Es gibt einen auffälligen Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetischeArchitektur1,2,3.
Dies lässt sich vielleicht am besten an den zahlreichen konvergenten Merkmalen von Gymnotiformen und Mormyriden, zwei artenreichen Teleostkladen, am besten, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und als schwach elektrische Fische bezeichnet werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität verwenden, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren4, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklunggewonnen 1,5 ,6, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften7,8,9,10, Zellphysiologie11,12, Ökologie und Energetik13 ,14,15,16,17, Verhalten18,19und Makroevolution3,20,21 .
In jüngerer Zeit gab es eine Vermehrung von genomischen, transkriptomischen und proteomischen Ressourcen für elektrische Fische1,22,23,24,25,26, 27,28. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten1,2,3,28,29 ,30. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten von schwach elektrischen Fischen ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools31.
Ein solches Tool ist die kürzlich entwickelte Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats gepaart mit Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) Technik. CRISPR/Cas9 ist ein Genom-Editing-Tool, das sowohl in Modell32,33,34 als auch in Nicht-Modellorganismen35,36,37 gleichermaßen weit verbreitet ist. Die CRISPR/Cas9-Technologie hat sich so weit entwickelt, dass ein Labor, das in der Lage ist, grundlegende Molekularbiologie zu verwenden, problemlos genspezifische Sonden, sogenannte Kurzguide-RNAs (sgRNAs), zu niedrigen Kosten mit einer Nicht-Klonmethode38erzeugen kann. CRISPR hat Vorteile gegenüber anderen Knockout/Knockdown-Strategien, wie Morpholinos39,40, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleases (TALENs) und Zinkfingernukleasen (ZFNs), die teuer und zeitaufwändig für jedes Zielgen zu generieren.
Das CRISPR/Cas9-System funktioniert, um Genknockouts zu erzeugen, indem es auf eine bestimmte Region des Genoms abzielt, die durch die sgRNA-Sequenz gesteuert wird, und einen doppelsträngigen Bruch verursacht. Der doppelsträngige Bruch wird von der Zelle nachgewiesen und löst endogene DNA-Reparaturmechanismen vorzugsweise über den nicht-homologen Endjoining (NHEJ) aus. Dieser Weg ist sehr fehleranfällig: Während des Reparaturprozesses wird das DNA-Molekül oft Insertionen oder Deletionen (Indels) an der doppelsträngigen Bruchstelle enthalten. Diese Indels können zu einem Funktionsverlust führen, entweder durch (1) Verschiebungen im offenen Leserahmen, (2) das Einfügen eines vorzeitigen Stop-Codons oder (3) Verschiebungen in der kritischen Primärstruktur des Genprodukts. In diesem Protokoll verwenden wir CRISPR/Cas9-Bearbeitung, um Punktmutationen in Zielgenen mit dem NHEJ in schwach elektrischen Fischarten zu zielen. Obwohl einfacher und effizienter als andere Techniken, wird diese Methode der Mutagenese voraussichtlich zu einer Reihe von phänotypischen Schweregraden in F0führen, die dem genetischenMosaik41,42,43 zugeschrieben wird. 44.
Auswahl von Organismen
Um zukünftige Studien zur vergleichenden Genomik schwach elektrischer Fische zu erleichtern, musste eine repräsentative Art für Gymnotiformen und Mormyriden für die Protokollentwicklung ausgewählt werden. Nach Diskussionen während des Electric Fish Meeting 2016 in Montevideo, Uruguay, gab es einen Konsens in der Gemeinschaft, Arten zu nutzen, die bereits im Labor gezüchtet werden konnten und über genomische Ressourcen verfügten. Die Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio und die mormyrid Brienomyrus brachyistius wurden als Arten ausgewählt, die diesen Kriterien entsprechen. Bei beiden Arten sind natürliche Hinweise zur Induzieren und Aufrechterhaltung der Brutbedingungen in Gefangenschaft leicht nachzuahmen. B. gauderio, eine Gymnotiforme-Art aus Südamerika, hat den Vorteil eines geringen Haltungsbedarfs: Fische können in relativ kleinen (4 L) Tanks mit relativ hoher Dichte gehalten werden. B. gauderio hat auch einen schnellen Generationenumsatz unter captiveBedingungen. Unter Laborbedingungen kann sich B. gauderio in ca. 4 Monaten vom Ei zum Erwachsenen entwickeln.
B. brachyistius, eine Art von mormyrid Fischen aus West-Zentralafrika, brütet leicht in Gefangenschaft. B. brachyistius ist leicht über den Aquarienhandel verfügbar, wurde in vielen Studien weit verbreitet und verfügt nun über eine Reihe von genomischen Ressourcen zur Verfügung. Ihr Lebenszyklus erstreckt sich je nach Laborbedingungen über 1 bis 3 Jahre. Die Anforderungen an die Haltung sind für diese Art etwas intensiver und erfordern aufgrund ihrer Aggression während der Zucht mäßig große Tanks (50-100 L).
Laboratorien, die andere Arten von elektroelektrischen Fischen untersuchen, sollten in der Lage sein, dieses Protokoll leicht anzupassen, solange die Art gezüchtet werden kann, und einzellige Embryonen können gesammelt und ins Erwachsenenalter gebracht werden. Die Wohnungs-, Larvenhaltungs- und In-vitro-Fertilisationsraten (IVF) werden sich wahrscheinlich mit anderen Arten ändern; Dieses Protokoll kann jedoch als Ausgangspunkt für Zuchtversuche in anderen schwach elektrischen Fischen verwendet werden.
Ein ideales Genziel für den Proof of Concept: scn4aa
Schwach elektrische mormyrid und gymnotiform Fische erzeugen elektrische Felder (Elektrogenese) durch das Entladen eines spezialisierten Organs, genannt das elektrische Organ. Elektrische Organentladungen (EODs) ergeben sich aus der gleichzeitigen Produktion von Aktionspotentialen in den elektrischen Organzellen, den sogenannten Elektrozyten. EODs werden von einer Reihe von Elektrorezeptoren in der Haut detektiert, um hochauflösende elektrische Bilder der Umgebung des Fisches zu erstellen45. Schwach elektrische Fische sind auch in der Lage, Merkmale der EOD-Wellenformen18 ihrer konspezifischen EOD sowie deren Entladungsraten46zu erkennen, so dass EODs zusätzlich als soziales Kommunikationssignal analog zu Vogelgezwitscher oder Frosch fungieren können. Vokalisationen47.
Ein Hauptbestandteil der Wirkungspotentialerzeugung in den Elektrozyten von mormyrid und gymnotiform schwach elektrischen Fischen istder spannungsgebundene Natriumkanal NaV1.42 . Nicht-elektrische Teleosts exprimieren zwei paralogische Genkopien, Scn4aa und Scn4ab, die für den spannungsgebundenen Natriumkanal NaV1.430kodieren. In gymnotiform und mormyrid schwach elektrische Fischlinien, Scn4aa hat sich schnell entwickelt und untergezogen zahlreiche Aminosäuresubstitutionen, die seine kinetischen Eigenschaften beeinflussen48. Am wichtigsten ist, scn4aa hat sich in beiden Linien zum elektrischen Organ2,3. Die relativ eingeschränkte Expression von Scn4aa auf das elektrische Organ sowie seine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von EODs machen es zu einem idealen Ziel für CRISPR/Cas9-Knockout-Experimente, da es minimale schädliche pleiotrope Effekte hat. Da schwach elektrische Fische 6-8 Tage nach der Befruchtung (DPF) beginnen, ihre larvenelektrischen Organe zu entladen, eignet sich die Gezielte ungegheiten von Scn4aa ideal für die schnelle Phänotypisierung nach der Embryo-Mikroinjektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der phänoseische Reichtum schwach elektrischer Fische, zusammen mit einer kürzlichen Verbreitung von Genomressourcen, motiviert einen starken Bedarf an funktionellen Genomwerkzeugen im schwach elektrischen Fischmodell. Dieses System ist besonders attraktiv wegen der konvergenten Entwicklung zahlreicher phänotypischer Merkmale in parallelen Fischlinien, die leicht im Labor gehalten werden können.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-Technik in Linien schwach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die heldenhaften Bemühungen von Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud und Hope Healey um Hilfe bei der Fischzucht, der Datensammlung und der frühen Protokollentwicklung. Wir möchten auch den drei Rezensenten für ihre Vorschläge zum Manuskript danken. Wir glauben, dass das Endprodukt von besserer Qualität ist, nachdem sie ihre Kommentare angesprochen haben. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der National Science Foundation #1644965 und #1455405 an JRG und die Stiftung Naturwissenschaften und Ingenieurforschung AN VLS finanziert.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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