JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

Published: November 15, 2019
doi:
10.3791/60478
,
1AG Oncophysiology,Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

Abstract

אנו מתארים שינוי של שיטה מבוססת לקביעת הדינמיקה המיקרוכדורית בתאי החיים. הפרוטוקול מבוסס על הביטוי של סמן מקודד גנטית עבור הקצוות החיוביים של microtubules (EB3 מתויג עם חלבון פלורסנט tdTomato) ו במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה, הדמיה של תא חי באמצעות מיקרוסקופ הדיסק מסתובב מיקרוסקופית. סנכרון התאים והצפיפות המוגברת של microtubules מתבצעים על ידי הפרדה מרבית בתאי הmitotic, וניתוח הצמיחה מבוצע באמצעות תוכנת U-Track של מקור פתוח. השימוש בחלבון פלורסנט בהיר ואדום הוזז, בשילוב עם כוח לייזר נמוך יותר וזמן חשיפה מופחת הנדרש עבור מיקרוסקופ דיסק מסתובב להפחית את הרעילות וההסתברות של חפצים המושרה באור. הדבר מאפשר הדמיה של מספר גדול יותר של תאים בהכנה זהה תוך שמירה על התאים במדיום גדילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים. מכיוון שהניתוח מבוצע באופן אוטומטי מפוקח, התוצאות הן עמידות סטטיסטית ומפוקחת.

Introduction

Microtubules (MTs) הם מבנים דינמיים מאוד למצוא כמעט כל התאים איקריוטית ובכמה חיידקים1. . הם מפסל את שלדהציטו2,3 תא החטיבה4, מולקולה הובלה5, מכות הדגל6, התחושה של הסביבה המקיפה דרך הסייום7, שמיעה (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, פלישה גרורות13,14, ואפילו היווצרות זיכרון15,16,17,18, ותהליכים רבים אחרים מסתמכים בעיקר על MTs. השתתפות MTs בכל האירועים הללו יהיה בלתי אפשרי ללא היכולת המדהימה שלהם לעבור במהירות בין הצמיחה (פלמור) והצטמקות (דפלוניזציה). מאפיין זה מתואר כאי-יציבות דינאמית19. הר הדינמיות משתנה בתנאים פתולוגיים רבים20,21,22. לפיכך, קביעת אופי הנכס יכול לעזור להבין את מנגנוני המחלות ולאחר מכן את הטיפול שלהם.

רשימה ארוכה של שיטות פותחו עבור ניתוח MT דינמיקה, שרובם מבוססים על טכניקות דימות23. בתחילה, מיקרוסקופים אור שדה רחב שימשו להתבוננות היווצרות פולימרים טובולין בתוך מבחנה24. הגילוי של מחייב הקצה (EB)-חלבונים שאוספים ב-MT פלוס-מסתיים ופיתוח של שיטות כדי לתייג חלבונים באנרגיה fluorescently אופן מאפשר לבחון את התנהגותו של MTs ישירות בתאים חיים עם שדה רחב ו-מיקרוסקופ מיקרוסקופים פלואורסצנטית25,26,27. EB-פרוטאין אחד הוא חלבון מחייב הקצה 3 (EB3)28; על ידי הבעת יתר ומעקב EB3 התמזגו חלבון פלורסנט, MT פלוס-end תעריפי ההרכבה ניתן לקבוע29,30.

לייזר confocal וקד סריקת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (CLSM) משמש לעתים קרובות כדי לעקוב MT הדינמיקה. עם זאת, טכניקת הדמיה זו מהווה סיכון גבוה לפוטורעילות ופוטוהלבנה, שני תהליכים לא רצויים עבור תא חי והדמיה לדוגמה עמומה31. כדי לקבל יחס טוב יותר של אות לרעש, את כוח הלייזר ואת משך החשיפה צריך להיות גבוה מספיק בעוד לא לפגוע בדגימות, וזה דורש הקרבת החלטה בתמורה למהירות. חלופה מתאימה ל-CLSM היא ספינינג32מיקרוסקופ דיסק. מודאליות זו מבוססת על השימוש של דיסק Nipkow33, אשר מורכב דיסק נע הנושאת מערך של חורים, ועובד אופן מיקרוסקופים CLS רבים הדמיה זהה בו34. לכן, האור מהלייזר יאיר מספר אזורים במדגם בו זמנית, אך ישמור על הטבע הטוב. הדיסק Nipkow, לכן, מאפשר קבלת תמונות דומות CLSM אבל מהיר יותר באמצעות כוח לייזר פחות. The Nipkow הדיסק היה שיפור נוסף על ידי Yokogawa אלקטריק, אשר הציג דיסק שני עם מערך של microlenses על זה כי בנפרד אור ישיר לתוך pinhole בהתאמה, הפחתת הרעילות הרבה יותר phototoxicity לבנת35. כך, מסתובב מיקרוסקופית דיסק סריקה לייזר הפכה לשיטה של בחירה עבור הדמיה תא חי, וזה מאפשר להשיג תמונות עם יחס אות לרעש גבוה במהירות גבוהה31,36, אשר חיוני לפתרון אותות כגון אלה מתוך הצמיחה המהירה MT.

הדינמיקה של MT שונה באופן זמני. לדוגמה, mitotic MTs הם דינמיים יותר מאשר האינטרפאזה37,38. באופן דומה, הבדלים בקצב הצמיחה הצטמקות נצפו גם בתוך שלב אותו מחזור התא, כגון מיטוזה39,40. לכן, כדי להימנע מאיסוף נתונים שווא, יש להגביל את המדידה של הדינמיקה של MT לחלון זמן צר במהלך מחזור התא. לדוגמה, מדידה של MT דינמיקה ב prometaphase ניתן להשיג על ידי טיפול בתאים עם dimethylenאסטרה (dme), אנלוגי monastrol המונע את המנוע קינזין Eg541 ומונע את היווצרות של הmitotic ציר דו-קוטבית42. עיכוב של תאים ב prometaphase עם Eg5 מעכבי dme ונגזרים monastrol אחרים לא משפיעים על MT דינמיקה43,44,45, מה שהופך dme כלי שימושי ללמוד mt דינמיקה הן בתאים קבועים וחיים44.

כאן אנו משלבים את השיטה של ניתוח הדינמיקה MT בתאים prometaphase שתוארו על ידי Ertych ואח ‘44 עם הדמיה דיסק מסתובב כפול. שיטה זו מאפשרת מדידה של הדינמיקה MT ב prometaphase תאים שנאספו ממישור מוקד אחד עם קצב הדמיה גבוה יותר, אך ללא הלבנת ומינימלית פוטורעילות. יתר על כן, כעיתונאי פלורסנט, אנו משתמשים בחלבון פלורסנט (tdTomato) הכולל בהירות ופוטויציבות לעומת חלבון פלורסנט ירוק (EGFP) והוא נרגש עם אור אנרגיה נמוכה46. לכן, tdTomato דורש פחות כוח לייזר עבור עירור והוא פחות פוטורעיל. בסך הכל, אנו משפרים עוד את השיטה על-ידי הפחתת הרעילות ושיפור הרזולוציה והטיפול בדואר הנדרש לניתוח הדינמיקה של MT. בנוסף, אנו יוצרים בסיס לשינויים עתידיים בשיטה על-ידי שילובם בשיטות סינכרון אחרות.

Protocol

1. זריעת תאי הלה להכין 2 מ ל של 5 μg/mL fibronectin פתרון ב פוספט באגירה מלוחים (PBS) ולהוסיף 450 μL של אותו לתוך כל טוב של 4 שמיכות היטב הצ (#1 .5). מודיית את השקופית עבור 15 דקות ב 37 ° צ’ ו 5% CO2. לשטוף באופן אסינכרוני בתאי הלה גדל עם מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) ו דגירה עם טריפסין-EDTA (0.05%: 0.02%; w:v) …

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול הנתון המתואר באיור 1A, ה-PEB3-tdTomato באופן מידי התבטא באופן מבוקר בתאי חלה הגדלים באופן אסינכרוני. התאים סונכרנו 48 h לאחר הprometaphase באמצעות טיפול DME (איור 1B). שלב זה הבטיח כי המדידה של MT דינמיקה נעשתה תמיד באותו שלב של מחזור התא. הסרטים בזמן הקפיצה הי…

Discussion

כאן, אנו מתארים שינוי של שיטה שהוקמה לראשונה על ידי ארפטיכון ואח ‘.44. יחד עם מספר שינויים אחרים, אנו משלבים את הטכניקה הזו של הניתוח MT דינמיקה עם הדמיה כפולה מסתובב הדיסק. השימוש בדיסק מסתובב כפול משפר את הרזולוציה של הגוברת MTs תוך הפחתת רעילות התמונה36. אנחנו עוד להק…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מתקן המיקרוסקופיה, מכון מקס פלנק לרפואה ניסויית, לייעוץ ולתמיכה המומחים שלהם.

Materials

Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. . Methods in Molecular Biology. , (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Nipkow, P. Elektrisches teleskop. Germany patent. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Tanaami, T., Kenta, M. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. , (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -. M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D’Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -. S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Microtubule DynamicsSpinning Disk MicroscopyMonopolar Mitotic SpindlesFluorescent ProteinPhototoxicityEB3TrypsinizationHeLa CellsTransfectionDimethylenastron (DME)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image