כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.
אנו מתארים שינוי של שיטה מבוססת לקביעת הדינמיקה המיקרוכדורית בתאי החיים. הפרוטוקול מבוסס על הביטוי של סמן מקודד גנטית עבור הקצוות החיוביים של microtubules (EB3 מתויג עם חלבון פלורסנט tdTomato) ו במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה, הדמיה של תא חי באמצעות מיקרוסקופ הדיסק מסתובב מיקרוסקופית. סנכרון התאים והצפיפות המוגברת של microtubules מתבצעים על ידי הפרדה מרבית בתאי הmitotic, וניתוח הצמיחה מבוצע באמצעות תוכנת U-Track של מקור פתוח. השימוש בחלבון פלורסנט בהיר ואדום הוזז, בשילוב עם כוח לייזר נמוך יותר וזמן חשיפה מופחת הנדרש עבור מיקרוסקופ דיסק מסתובב להפחית את הרעילות וההסתברות של חפצים המושרה באור. הדבר מאפשר הדמיה של מספר גדול יותר של תאים בהכנה זהה תוך שמירה על התאים במדיום גדילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים. מכיוון שהניתוח מבוצע באופן אוטומטי מפוקח, התוצאות הן עמידות סטטיסטית ומפוקחת.
Microtubules (MTs) הם מבנים דינמיים מאוד למצוא כמעט כל התאים איקריוטית ובכמה חיידקים1. . הם מפסל את שלדהציטו2,3 תא החטיבה4, מולקולה הובלה5, מכות הדגל6, התחושה של הסביבה המקיפה דרך הסייום7, שמיעה (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, פלישה גרורות13,14, ואפילו היווצרות זיכרון15,16,17,18, ותהליכים רבים אחרים מסתמכים בעיקר על MTs. השתתפות MTs בכל האירועים הללו יהיה בלתי אפשרי ללא היכולת המדהימה שלהם לעבור במהירות בין הצמיחה (פלמור) והצטמקות (דפלוניזציה). מאפיין זה מתואר כאי-יציבות דינאמית19. הר הדינמיות משתנה בתנאים פתולוגיים רבים20,21,22. לפיכך, קביעת אופי הנכס יכול לעזור להבין את מנגנוני המחלות ולאחר מכן את הטיפול שלהם.
רשימה ארוכה של שיטות פותחו עבור ניתוח MT דינמיקה, שרובם מבוססים על טכניקות דימות23. בתחילה, מיקרוסקופים אור שדה רחב שימשו להתבוננות היווצרות פולימרים טובולין בתוך מבחנה24. הגילוי של מחייב הקצה (EB)-חלבונים שאוספים ב-MT פלוס-מסתיים ופיתוח של שיטות כדי לתייג חלבונים באנרגיה fluorescently אופן מאפשר לבחון את התנהגותו של MTs ישירות בתאים חיים עם שדה רחב ו-מיקרוסקופ מיקרוסקופים פלואורסצנטית25,26,27. EB-פרוטאין אחד הוא חלבון מחייב הקצה 3 (EB3)28; על ידי הבעת יתר ומעקב EB3 התמזגו חלבון פלורסנט, MT פלוס-end תעריפי ההרכבה ניתן לקבוע29,30.
לייזר confocal וקד סריקת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (CLSM) משמש לעתים קרובות כדי לעקוב MT הדינמיקה. עם זאת, טכניקת הדמיה זו מהווה סיכון גבוה לפוטורעילות ופוטוהלבנה, שני תהליכים לא רצויים עבור תא חי והדמיה לדוגמה עמומה31. כדי לקבל יחס טוב יותר של אות לרעש, את כוח הלייזר ואת משך החשיפה צריך להיות גבוה מספיק בעוד לא לפגוע בדגימות, וזה דורש הקרבת החלטה בתמורה למהירות. חלופה מתאימה ל-CLSM היא ספינינג32מיקרוסקופ דיסק. מודאליות זו מבוססת על השימוש של דיסק Nipkow33, אשר מורכב דיסק נע הנושאת מערך של חורים, ועובד אופן מיקרוסקופים CLS רבים הדמיה זהה בו34. לכן, האור מהלייזר יאיר מספר אזורים במדגם בו זמנית, אך ישמור על הטבע הטוב. הדיסק Nipkow, לכן, מאפשר קבלת תמונות דומות CLSM אבל מהיר יותר באמצעות כוח לייזר פחות. The Nipkow הדיסק היה שיפור נוסף על ידי Yokogawa אלקטריק, אשר הציג דיסק שני עם מערך של microlenses על זה כי בנפרד אור ישיר לתוך pinhole בהתאמה, הפחתת הרעילות הרבה יותר phototoxicity לבנת35. כך, מסתובב מיקרוסקופית דיסק סריקה לייזר הפכה לשיטה של בחירה עבור הדמיה תא חי, וזה מאפשר להשיג תמונות עם יחס אות לרעש גבוה במהירות גבוהה31,36, אשר חיוני לפתרון אותות כגון אלה מתוך הצמיחה המהירה MT.
הדינמיקה של MT שונה באופן זמני. לדוגמה, mitotic MTs הם דינמיים יותר מאשר האינטרפאזה37,38. באופן דומה, הבדלים בקצב הצמיחה הצטמקות נצפו גם בתוך שלב אותו מחזור התא, כגון מיטוזה39,40. לכן, כדי להימנע מאיסוף נתונים שווא, יש להגביל את המדידה של הדינמיקה של MT לחלון זמן צר במהלך מחזור התא. לדוגמה, מדידה של MT דינמיקה ב prometaphase ניתן להשיג על ידי טיפול בתאים עם dimethylenאסטרה (dme), אנלוגי monastrol המונע את המנוע קינזין Eg541 ומונע את היווצרות של הmitotic ציר דו-קוטבית42. עיכוב של תאים ב prometaphase עם Eg5 מעכבי dme ונגזרים monastrol אחרים לא משפיעים על MT דינמיקה43,44,45, מה שהופך dme כלי שימושי ללמוד mt דינמיקה הן בתאים קבועים וחיים44.
כאן אנו משלבים את השיטה של ניתוח הדינמיקה MT בתאים prometaphase שתוארו על ידי Ertych ואח ‘44 עם הדמיה דיסק מסתובב כפול. שיטה זו מאפשרת מדידה של הדינמיקה MT ב prometaphase תאים שנאספו ממישור מוקד אחד עם קצב הדמיה גבוה יותר, אך ללא הלבנת ומינימלית פוטורעילות. יתר על כן, כעיתונאי פלורסנט, אנו משתמשים בחלבון פלורסנט (tdTomato) הכולל בהירות ופוטויציבות לעומת חלבון פלורסנט ירוק (EGFP) והוא נרגש עם אור אנרגיה נמוכה46. לכן, tdTomato דורש פחות כוח לייזר עבור עירור והוא פחות פוטורעיל. בסך הכל, אנו משפרים עוד את השיטה על-ידי הפחתת הרעילות ושיפור הרזולוציה והטיפול בדואר הנדרש לניתוח הדינמיקה של MT. בנוסף, אנו יוצרים בסיס לשינויים עתידיים בשיטה על-ידי שילובם בשיטות סינכרון אחרות.
כאן, אנו מתארים שינוי של שיטה שהוקמה לראשונה על ידי ארפטיכון ואח ‘.44. יחד עם מספר שינויים אחרים, אנו משלבים את הטכניקה הזו של הניתוח MT דינמיקה עם הדמיה כפולה מסתובב הדיסק. השימוש בדיסק מסתובב כפול משפר את הרזולוציה של הגוברת MTs תוך הפחתת רעילות התמונה36. אנחנו עוד להק…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מתקן המיקרוסקופיה, מכון מקס פלנק לרפואה ניסויית, לייעוץ ולתמיכה המומחים שלהם.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |