Medição da dinâmica do microtúbulo girando microscopia do disco em fusos mitocticos monopolares

Summary

Aqui apresentamos um método robusto e detalhado de análise da dinâmica dos microtúbulos em células sincronizadas em prometaphase usando microscopia confocal de disco giratório de células vivas e processamento de imagem baseado em MATLAB.

Abstract

Descrevemos uma modificação de um método estabelecido para determinar a dinâmica dos microtúbulos nas células vivas. O protocolo é baseado na expressão de um marcador geneticamente codificado para as extremidades positivas dos microtúbulos (EB3 rotulado com proteína fluorescente tdTomato) e imagens de células vivas de alta velocidade, alta resolução, usando microscopia confocal de disco giratório. A sincronização do ciclo celular e o aumento da densidade de microtúbulos são alcançados inibindo a separação centrosomal em células mitocômicas, e a análise do crescimento é realizada usando software u-track de código aberto. O uso de uma proteína fluorescente brilhante e em vermelho, em combinação com o menor poder laser e o tempo de exposição reduzido necessário para a microscopia de disco giratório, reduzem a fototoxicidade e a probabilidade de artefatos induzidos pela luz. Isso permite a imagem de um número maior de células na mesma preparação, mantendo as células em um meio de crescimento condições de cultura padrão. Como a análise é realizada de forma automática supervisionada, os resultados são estatisticamente robustos e reprodutíveis.

Introduction

Microtubules (MTs) são estruturas altamente dinâmicas encontradas em praticamente todas as células eucarióticas e em algumas bactérias¹. Juntamente com a actina e filamentos intermediários, eles esculpem o citoesqueleto^2,3. Divisão celular^4,transporte de^{moléculas 5,}flagelar batendo^6,a sensação do ambiente circundante através do clácia primário⁷, audição (kinocilium)^8,9,embrionênese^10,11,12, invasão e metástase^13,14,e até mesmo formação de memória^15,16,17,18, e muitos outros processos dependem principalmente de MTs. A participação de MTs em todos esses eventos seria impossível sem sua notável capacidade de alternar rapidamente entre crescimento (polimerização) e encolhimento (despolimerização). Esta propriedade é descrita como instabilidade dinâmica^19. A dinâmica do MT é alterada em muitas condições patológicas^20,21,22. Assim, determinar a natureza desta propriedade pode ajudar a compreender mecanismos da doença e subseqüentemente seu tratamento.

Uma longa lista de métodos foi desenvolvida para a análise da dinâmica MT, a maioria dos quais são baseados em técnicas de imagem²³. Inicialmente, microscópios de luz de campo largo foram utilizados para observar a formação de polímeros de tubulina in vitro²⁴. A descoberta de proteínas end-binding (EB) que se coletam em MT plus-ends e o desenvolvimento de métodos para rotular fluorescentemente proteínas possibilitou observar o comportamento das MTs diretamente em células vivas com amplo campo e microscópios de fluorescência confocal^25,26,27. Uma proteína EB é a proteína de ligação final 3 (EB3)^28; expressando e rastreando eB3 com uma proteína fluorescente, as taxas de montagem mt plus-end podem ser determinadas^29,30.

A microscopia de fluorescência da exploração a laser confocal (CLSM) é frequentemente usada para acompanhar a dinâmica do MT. No entanto, esta técnica de imagem representa um alto risco de fototoxicidade e fotobranqueamento, dois processos indesejáveis para células vivas e imagens de amostra dim³¹. A fim de obter uma melhor relação sinal-ruído, a potência do laser e a duração da exposição devem ser altas o suficiente, sem danificar as amostras, e isso requer sacrificar a resolução em troca de velocidade. Uma alternativa adequada ao CLSM é a microscopia de disco giratório^32. Esta modalidade de imagem é baseada no uso de um disco Nipkow³³, que consiste em um disco em movimento com uma matriz de furos, e funciona de forma equivalente a muitos microscópios CLS imagens da mesma amostra simultaneamente³⁴. Portanto, a luz do laser iluminará várias regiões da amostra simultaneamente, mas manterá a natureza confocal. O disco nipkow, portanto, permite a obtenção de imagens semelhantes ao CLSM, mas mais rápido e usando menos energia a laser. O disco Nipkow foi ainda melhor pelo Yokogawa Electric, que introduziu um segundo disco com uma variedade de microlentes sobre ele que individualmente direcionar a luz em um pinhole respectivos, reduzindo ainda mais fototoxicidade e fotobranqueamento³⁵. Assim, a microscopia de digitalização a laser de disco giratório tornou-se um método de escolha para imagens de células vivas, e torna possível obter imagens com alta relação sinal-ruído em alta velocidade^31,36, o que é crucial para resolver sinais como os das extremidades de rápido crescimento do MT.

A dinâmica do MT difere temporariamente. Por exemplo, as MTs mitocôticas são mais dinâmicas do que as^{interfases 37,38.} Da mesma forma, diferenças na taxa de crescimento e encolhimento têm sido observadas mesmo dentro da mesma fase do ciclo celular, como a mitose^39,40. Portanto, para evitar a coleta de dados falsos, a medição da dinâmica do MT deve ser limitada a uma janela de tempo estreita durante o ciclo celular. Por exemplo, a medição da dinâmica mt na prometaphase pode ser alcançada através do tratamento das células com dimenastron (DME), um análogo monastrol que inibe o motor kinesin Eg5⁴¹ e impede a formação do fuso mitomático⁴². Inibição de células em prometaphase com DME inibidor eg5 e outros derivados monastrois não afeta a dinâmica MT^43,44,45, o que torna DME uma ferramenta útil para estudar a dinâmica mt tanto em células fixas e vivas⁴⁴.

Aqui combinamos o método de análise de dinâmica MT em células prometaphase descritas por Ertych et al.⁴⁴ com imagens de disco de fiação dupla. Este método permite a medição da dinâmica mt em células prometaphase coletadas a partir de um único plano focal com uma maior taxa de imagem, mas sem fotobranqueamento e fototoxicidade mínima. Além disso, como repórter fluorescente, usamos proteína fluorescente de tomate tandem dimer (tdTomato), que melhorou o brilho e a fotostabilidade em comparação com a proteína fluorescente verde (EGFP) e está animada com luz de energia mais baixa⁴⁶. Portanto, tdTomato requer menos energia laser para excitação e é menos fototóxico. Ao todo, melhoramos ainda mais o método, reduzindo a fototoxicidade e melhorando a resolução e pós-processamento necessários para a análise da dinâmica do MT. Além disso, criamos uma base para futuras modificações do método, combinando-o com outras técnicas de sincronização.

Protocol

1. Semeadura de células HeLa Prepare 2 mL de 5 μg/mL solução de fibronectina em soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e adicione 450 μL dele em cada poço de um coverslip de 4 poços com câmara (#1,5). Incubar o slide por 15 min a 37 °C e 5% CO2. Enxágüe células HeLa de crescimento assíncrono com a soro-sinodiada de Dulbecco (DPBS) e incubada com trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) por 5 min a 37 °C. Pare a reação enzimática pela adição do Roswell Park Memorial Institut…

Representative Results

Seguindo o protocolo dado esboçado na figura 1A,o plasmid do pEB3-tdTomato foi expressado transitonte em pilhas assynchronously crescentes de HeLa. As células foram sincronizadas 48 h após a transfecção na prometaphase através do tratamento de DME (Figura 1B). Esta etapa garantiu que a medição da dinâmica do MT fosse feita sempre na mesma fase do ciclo da pilha. Os filmes de lapso de tempo foram processados e analisados com U-Track v2.2.0 como descrito …

Discussion

Aqui, descrevemos uma modificação de um método estabelecido pela primeira vez por Ertych et al.⁴⁴. Junto com várias outras modificações, combinamos esta técnica de análise de dinâmica MT com imagens confocais de disco de fiação dupla. O uso do disco de fiação dupla melhora a resolução de MTs em crescimento, reduzindo a fototoxicidade^36. Reduzimos ainda mais o photobleaching e os danos induzidos pela luz laser das células, mudando para um repórter fluorescen…

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software