Medición de microtúbulos dinámicos mediante microscopía de disco giratorio en husillos mitoticos Monopolar

Summary

Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.

Abstract

Describimos una modificación de un método establecido para determinar la dinámica de microtúbulos en células vivas. El protocolo se basa en la expresión de un marcador codificado genéticamente para los extremos positivos de los microtúbulos (EB3 etiquetado con proteína fluorescente tdTomato) y la imagen de células vivas de alta velocidad y alta resolución mediante microscopía confocal de disco giratorio. La sincronización del ciclo celular y el aumento de la densidad de los microtúbulos se logran mediante la inhibición de la separación centrosómica en células mitoticas, y el análisis del crecimiento se realiza utilizando el software U-Track de código abierto. El uso de una proteína fluorescente brillante y de cambio de rojo, en combinación con la menor potencia láser y el tiempo de exposición reducido necesario para la microscopía de disco giratorio reducen la fototoxicidad y la probabilidad de artefactos inducidos por la luz. Esto permite tomar imágenes de un mayor número de células en la misma preparación mientras se mantienen las células en un medio de crecimiento bajo condiciones de cultivo estándar. Debido a que el análisis se realiza de forma automática supervisada, los resultados son estadísticamente robustos y reproducibles.

Introduction

Los microtúbulos (MT) son estructuras altamente dinámicas que se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas y en algunas bacterias^1. Junto con la actina y los filamentos intermedios, esculpen el citoesqueleto^2,3. División celular⁴, transporte de moléculas⁵, flagelante golpeando⁶, la sensación del entorno circundante a través del cilium primario⁷, audición (kinocilium)^8,9, embriogénesis^10,11,12, invasión y metástasis^13,14, e incluso la formación de la memoria^15,16,17,18, y muchos otros procesos se basan principalmente en los TM. La participación de los MT en todos estos eventos sería imposible sin su notable capacidad de cambiar rápidamente entre el crecimiento (polimerización) y la contracción (despolimerización). Esta propiedad se describe como inestabilidad dinámica¹⁹. La dinámica MT se altera en muchas condiciones patológicas^20,21,22. Por lo tanto, determinar la naturaleza de esta propiedad puede ayudar a entender los mecanismos de la enfermedad y posteriormente su tratamiento.

Se ha desarrollado una larga lista de métodos para el análisis de dinámica MT, la mayoría de los cuales se basan en técnicas de imagen^23. Inicialmente, se utilizaron microscopios de luz de campo amplio para observar la formación de polímeros de tubulina in vitro^24. El descubrimiento de proteínas de unión final (EB) que se acumulan en MT plus-ends y el desarrollo de métodos para etiquetar fluorescentes proteínas hicieron posible observar el comportamiento de los MT directamente en células vivas con microscopios de fluorescencia confocal esdecir de campo ancho y confocal^25,26,27. Una proteína EB es proteína de unión final 3 (EB3)²⁸; mediante la sobreexpresión y el seguimiento de EB3 fusionado con una proteína fluorescente, MT plus-end tasas de montaje se pueden determinar^29,30.

La microscopía de fluorescencia de escaneo láser confocal (CLSM) se utiliza con frecuencia para seguir la dinámica de MT. Sin embargo, esta técnica de diagnóstico por imágenes supone un alto riesgo de fototoxicidad y fotoblanqueo, dos procesos indeseables para las imágenes de células vivas y muestras tenues^31. Con el fin de obtener una mejor relación señal-ruido, la potencia del láser y la duración de la exposición deben ser lo suficientemente altas mientras que no dañan las muestras, y esto requiere sacrificar la resolución a cambio de la velocidad. Una alternativa adecuada a CLSM es la microscopía de disco giratorio^32. Esta modalidad de imagen se basa en el uso de un disco Nipkow^33,que consiste en un disco en movimiento que lleva una serie de agujeros, y funciona de forma equivalente a muchos microscopios CLS que toma imágenes de la misma muestra simultáneamente^34. Por lo tanto, la luz del láser iluminará varias regiones de la muestra simultáneamente, pero conservará la naturaleza confocal. El disco Nipkow, por lo tanto, permite obtener imágenes similares a CLSM pero más rápido y utilizando menos potencia láser. El disco nipkow fue mejorado aún más por Yokogawa Electric, que introdujo un segundo disco con una serie de microlentes que dirigen individualmente la luz en un agujero respectivo, reduciendo aún más la fototoxicidad y el fotoblanqueo^35. Por lo tanto, la microscopía de escaneo láser de disco giratorio se convirtió en un método de elección para la creación de imágenes de células en vivo, y permite obtener imágenes con alta relación señal-ruido a una alta velocidad^31,36, que es crucial para resolver señales como las de los extremos MT de rápido crecimiento.

La dinámica de MT difiere temporalmente. Por ejemplo, los MT mitoticos son más dinámicos que los interfásicos^37,38. Del mismo modo, se han observado diferencias en la tasa de crecimiento y la contracción incluso dentro de la misma fase del ciclo celular, como la mitosis^39,40. Por lo tanto, para evitar la recopilación de datos falsos, la medición de la dinámica de MT debe limitarse a una ventana de tiempo estrecha durante el ciclo de celda. Por ejemplo, la medición de la dinámica MT en prometafase se puede lograr mediante el tratamiento de las células con dimetilenasnía (DME), un análogo monastrol que inhibe la quinesina motora Eg5⁴¹ y evita la formación del husillo mitotico bipolar^42. La inhibición de células en prometafase con inhibidor de Eg5 DME y otros derivados monastrolno no afecta a la dinámica MT^43,44,45, lo que hace de DME una herramienta útil para el estudio de la dinámica MT tanto en células fijas como vivas^44.

Aquí combinamos el método de análisis de dinámica MT en células prometifásicas descrito por Ertych et al.⁴⁴ con imágenes de disco giratorios duales. Este método permite medir la dinámica de MT en células de prometafase recogidas de un solo plano focal con una mayor tasa de diagnóstico por imágenes, pero sin fotoblanqueo y fototoxicidad mínima. Además, como reportero fluorescente, utilizamos dimer tándem Proteína fluorescente de tomate (tdTomato) que ha mejorado el brillo y la fotoestabilidad en comparación con la proteína fluorescente verde (EGFP) y se excita con menor luz de energía⁴⁶. Por lo tanto, tdTomato requiere menos potencia láser para la excitación y es menos fototóxico. En conjunto, mejoramos aún más el método reduciendo la fototoxicidad y mejorando la resolución y el postprocesamiento necesarios para el análisis de dinámica MT. Además, creamos una base para futuras modificaciones del método combinándolo con otras técnicas de sincronización.

Protocol

1. Sembrado de células helancos Preparar 2 ml de solución de fibronectina de 5 g/ml en solución salina tamponada de fosfato (PBS) y añadir 450 ml de ella en cada pocal de un cubreobjetos de 4 cámaras bien (#1.5). Incubar el tobogán durante 15 min a 37oC y 5%CO2. Enjuague las células de HeLa de crecimiento asíncrono con solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) e incubar con trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) durante 5 min a 37 oC. Detener la reacción enzimática medi…

Representative Results

Siguiendo el protocolo dado descrito en la Figura 1A, el plásmido pEB3-tdTomato se expresó transitoriamente en células HeLa de crecimiento asíncrono. Las células se sincronizaron 48 horas después de la transfección en prometafase a través del tratamiento DME(Figura 1B). Este paso aseguró que la medición de la dinámica MT siempre se realizaba en la misma fase del ciclo celular. Las películas de lapso de tiempo se procesaron y analizaron con U-Track v2…

Discussion

Aquí, describimos una modificación de un método establecido por primera vez por Ertych et al.⁴⁴. Junto con varias otras modificaciones, combinamos esta técnica de análisis de dinámica MT con imágenes confocales de disco giratorio dual. El uso del disco giratorio dual mejora la resolución de los TM en crecimiento al tiempo que reduce la fototoxicidad^36. Reducimos aún más el fotoblanqueo y el daño inducido por la luz láser de las células cambiando a un reportero …

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software