Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel
Summary
Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.
Abstract
Experimentele analyse van cellen die zich verdelen in levende, intacte weefsels en organen is essentieel voor ons begrip van hoe celdeling integreert met ontwikkeling, weefselhomeostase en ziekteprocessen. Drosophila spermatocyten die meiose ondergaan zijn ideaal voor deze analyse omdat (1) hele Drosophila-testes die spermatocyten bevatten relatief eenvoudig te bereiden zijn op microscopie, (2) de grote afmetingen van de spermatocyten maken ze zeer geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie en (3) krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen kunnen worden geïntegreerd met in vivo analyse. Hier presenteren we een gemakkelijk toegankelijk protocol voor de voorbereiding van hele teelballen van Drosophila derde instar larven en vroege poppen. We beschrijven hoe je meiotische spermatocyten identificeren in voorbereide hele teelballen en hoe ze in beeld kunnen worden gebracht door time-lapse microscopie. Protocollen voor fixatie en immunostaining hele teelballen zijn ook voorzien. Het gebruik van larve teelballen heeft verschillende voordelen ten opzichte van beschikbare protocollen die volwassen teelballen gebruiken voor spermatocytenanalyse. Het belangrijkste is dat larve teelballen kleiner en minder vol zijn met cellen dan volwassen teelballen, en dit vergemakkelijkt sterk hoge resolutie beeldvorming van spermatocyten. Om deze voordelen en de toepassingen van de protocollen aan te tonen, presenteren we resultaten die de herverdeling van het endoplasmatische reticulum tonen met betrekking tot spindelmicrotubuli tijdens celdeling in een enkele spermatocyten die zijn afgebeeld door time-lapse confocale microscopie. De protocollen kunnen worden gecombineerd met expressie van een willekeurig aantal fluorescerende gelabelde eiwitten of organellemarkers, evenals genmutaties en andere genetische hulpmiddelen, waardoor deze benadering bijzonder krachtig is voor de analyse van celdelingmechanismen in de fysiologische context van hele weefsels en organen.
Introduction
Celdeling wordt vaak bestudeerd met behulp van cellijnen gekweekt in cultuur1. Hoewel we een schat aan waardevol inzicht en begrip van fundamentele mechanismen uit deze studies hebben opgedaan2,kunnen cellen die in cultuur worden gekweekt de fysiologie van celdeling niet volledig samenvatten omdat het voorkomt in intact, levend weefsel. In intacte weefsels en organen moeten cellen zich bijvoorbeeld op de juiste plaats en op het juiste moment verdelen, zodat nageslachtcellen zich goed in het weefsel bevinden, zodat ze passende differentiatie of functionele programma’s kunnen ondergaan, zodat celproliferatie goed wordt gecoördineerd met weefselgroei of homeostase3. Voor cellen die in cultuur worden gekweekt, wordt celdeling over het algemeen geregeld door groeifactoren in het kweekmedium4, en dus kunnen we niet van deze cellen leren hoe in vivo omgevingsfactoren zoals weefselarchitectuur of ontwikkelingssignalering het delingproces beïnvloeden. Het is ook belangrijk op te merken dat veel van de cellijnen die worden gebruikt om celdeling te bestuderen, zoals HeLa en U2OS-cellen, waren afgeleid van gemetastaseerde tumoren5. Daarom zijn veel aspecten van de basisfysiologie van deze kankercellen, zoals celcyclus regulerende mechanismen en chromosomale stabiliteit, waarschijnlijk veranderd in vergelijking met gezonde cellen. Volledig begrip van de fysiologie van de celdeling hangt daarom af van ons vermogen om delende cellen in hun eigen, in vivo omgevingen te bestuderen die fysiologische regulerende mechanismen en weefselarchitectuur behouden.
Vooruitgang bij het begrijpen van de werking van celdeling in intacte weefsels en organen wordt belemmerd door moeilijkheden die inherent zijn aan in vivo of ex vivo analyse. Ten eerste kan het moeilijk of onmogelijk zijn om toegang te krijgen tot delende cellen voor microscopische analyse in grote organen of dikke weefsels. Ten tweede is het vaak moeilijk te voorspellen wanneer individuele cellen zich in vivo zullen verdelen. Ten derde kan de weefselfysiologie snel verslechteren tijdens de ex vivo-cultuur. In dit protocol beschrijven we gemakkelijk toegankelijke methoden voor live en vaste analyse van Drosophila melanogaster spermatocyten omdat ze meiotische celdelingen ondergaan binnen volledig intacte teelballen. Deze cellen zijn ideaal voor live, ex vivo analyse omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn met standaard optische methoden zoals confocale microscopie, ze verdelen op voorspelbare tijden en locaties, en intacte teelballen kunnen worden gehandhaafd in ex vivo cultuur voor ongeveer 24 uur. Bovendien zijn Drosophila spermatocyten grote ronde cellen (ongeveer 20-30 μm in diameter) die niet van vorm veranderen wanneer ze zich verdelen, waardoor ze ideaal zijn voor hoge resolutie, time-lapse beeldvorming van cellulaire componenten zoals het spindelapparaat en cytoplasmale organellen. Hoewel deze cellen meiose ondergaan in tegenstelling tot mitose, zijn veel van de essentiële celdelingprocessen zeer vergelijkbaar tussen deze twee celdelingmechanismen6. Deze voordelen, gecombineerd met krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen, hebben Drosophila spermatocyten een veelgebruikt model voor ex vivo analyse van essentiële celdelingprocessen met inbegrip van asvorming en regelgeving, cytokinese, en organelle het remodelleren en het verdelen7gemaakt,8,9,10,11.
Spermatocyten zijn cellen die zich in het meinotische stadium van spermatogenese bevinden. In Drosophilabegint spermatogenese met een groep kiembaanstamcellen die zich in een klein gebied bevinden of “hub” op één pool van de testis12,13. Deze cellen delen door een asymmetrische mitose, die aanleiding geeft tot een enkele gedifferentieerde spermatogonium. Spermatogonia ondergaan vervolgens vier synchrone mitosen om een groep van 16 cellen te produceren die nauw verbonden blijven binnen een enkele cyste. In dit stadium gaan de cellen over van een mitotische naar een menotische celcyclus en worden ze spermatocyten genoemd. Spermatocyten brengen ongeveer twee tot drie dagen door in een verlengde G2-fase van de celcyclus, waarin ze dramatisch groeien en cytologische veranderingen ondergaan in de voorbereiding op de twee meiotische divisies en de daaropvolgendezaadsperma13,14. De hele groep van 16 spermatocyten binnen een enkele cyste gaat vervolgens tegelijkertijd de eerste meiotische divisie in. Zo kunnen verschillende meiotische spermatocyten tegelijkertijd worden afgebeeld terwijl ze door celdeling gaan. De eerste meiotische divisie gaat ongeveer 1,5 uur te werk en wordt vrijwel onmiddellijk gevolgd door de tweede menotische divisie, die in totaal 64 spermatids oplevert die zich gaan onderscheiden in volwassen spermatozoa.
Een uniek voordeel van het gebruik van spermatocyten om celdeling in levend, intact weefsel te bestuderen, is dat groepen of cysten van cellen voortdurend vooruitgang boeken in de verschillende stadia van spermatogenese, en cellen in alle stadia van spermatogenese kunnen meestal worden geïdentificeerd in een bepaalde testis (zie figuur 3A). Daarom is het relatief eenvoudig om meiotische cellen in hele teelballen te vinden. Over het algemeen richten we onze analyses op de eerste in plaats van op tweede meiose, omdat deze cellen veel groter en beter vatbaar zijn voor beeldvorming met hoge resolutie, maar het hele proces dat beide meiotic-divisies omvat, kan met succes worden weergegeven. Er moet ook worden opgemerkt dat het algemene protocol voor testisvoorbereiding en -cultuur ook kan worden gebruikt om andere processen van spermatogenese te analyseren, zoals de eerdere mitotische stamcel- of spermatogonale divisies of de cytologische veranderingen die optreden als spermatids rijpen in spermatozoa15. Veel van deze aspecten van spermatogenese zijn zeer bewaard gebleven tussen Drosophila en mensen16.
Drosophila spermatocyten beginnen de meiotische fase van spermatogenese te bereiken tijdens het derde instar larve stadium van Drosophila ontwikkeling13. Daarom kunnen teelballen geïsoleerd vanaf levenscyclusstadia die beginnen met derde instarlarven en met inbegrip van poppen en volwassenen worden gebruikt voor de analyse van delende spermatocyten. Er zijn verschillende uitstekende protocollen beschikbaar voor de extractie van teelballen van volwassen mannelijke vliegen voor levende en vaste analyse van spermatogenese17,18,19. Deze protocollen kunnen de voorkeur hebben voor het bestuderen van late stadia van spermatogenese of als genetische markers die alleen zichtbaar zijn bij volwassenen moeten worden gebruikt. Het protocol richt zich in plaats daarvan op testisvoorbereiding van larven en vroege poppen, omdat teelballen in deze stadia verschillende voordelen hebben die specifiek relevant zijn voor celdelinganalyse door hoge resolutie, time-lapse microscopie. Ten eerste zijn teelballen van larven en poppen kleiner dan die van volwassenen en zijn de cellen in het orgaan minder druk. Hierdoor kunnen delende spermatocyten vaak worden afgebeeld in de buurt van het buitenoppervlak van larve teelballen, zonder dat ze door meerdere lagen lichtverstrooiend weefsel hoeven te dringen. Ten tweede bewegen volwassen teelballen ritmisch als gevolg van samentrekkingen van de bijgevoegde accessoireorganen, en deze bewegingen maken time-lapse beeldvorming van individuele cellen uitdagend. En ten derde, larve teelballen zijn voordelig bij het bestuderen van genmutaties die pop of volwassen dodelijkheid veroorzaken. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor de lange termijn cultuur van teelballen op de microscoop fase, waardoor beeldvorming van meerdere rondes van celdeling of de progressie van individuele cellen door meerdere stadia van spermatogenese in hetzelfde preparaat. We beschrijven ook een protocol voor fixatie en immunostaining van hele teelballen. Over het algemeen zijn onze protocollen bijzonder nuttig voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van celdeling in intact weefsel, en de mogelijkheid om spermatocytenanalyse te combineren met zeer hardnekkige Drosophila genetische hulpmiddelen maakt dit een bijzonder krachtige aanpak.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een protocol beschreven voor de voorbereiding van larve of vroege pupal Drosophila-teelballen, geoptimaliseerd voor langdurige, live beeldvorming van spermatocytenceldeling. Dit is een krachtige methode voor de analyse van celdeling in de fysiologische context van intact weefsel. De kracht van deze methode wordt verder uitgebreid in combinatie met Drosophila genetische hulpmiddelen, zoals specifieke genmutaties, weefselspecifieke RNAi-gemedieerde onderdrukking en fluorescerend gelabelde eiwit-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie start-up fondsen aan J.T.S.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. . Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
