Подготовка Drosophila Ларваль и Pupal Тесты для анализа клеточного отдела в прямом эфире, Intact Ткани

Summary

Целью этого протокола является анализ деления клеток в нетронутой ткани живой и фиксированной клеточной микроскопией с использованием дрозофилы мейотических сперматозитов. Протокол демонстрирует, как изолировать целые, нетронутые яички от личинок Дрозофилы и ранних куколок, и как обрабатывать и монтировать их для микроскопии.

Abstract

Экспериментальный анализ клеток, делящихся в живых, нетронутых тканей и органов имеет важное значение для нашего понимания того, как деление клеток интегрируется с развитием, ткани гомеостаза, и болезни процессов. Дрозофилы сперматоцитов, проходящих мейоз идеально подходит для этого анализа, потому что (1) целые яички Drosophila, содержащие сперматозиты относительно легко подготовиться к микроскопии, (2) сперматозитов ‘большой размер делает их хорошо подходит для изображения высокого разрешения, и (3) мощные дрозофилы генетические инструменты могут быть интегрированы с виво-анализом. Здесь мы представляем легко доступный протокол для подготовки целых яичек из Drosophila третьих личинок и ранних куколк. Мы описываем, как идентифицировать мейотические сперматозиты в подготовленных целых яичках и как их изобразить с помощью замедленной микроскопии. Предусмотрены также протоколы фиксации и иммуноспоминации целых яичек. Использование личиночных яичек имеет ряд преимуществ по сравнению с имеющимися протоколами, которые используют взрослые яички для анализа сперматозоидов. Самое главное, личиночные яички меньше и менее переполнены клетками, чем взрослые яички, и это значительно облегчает высокое разрешение изображения сперматоций. Чтобы продемонстрировать эти преимущества и применение протоколов, мы представляем результаты, показывающие перераспределение эндоплазмического ретикулума по отношению к микротрубочкам шпинделя во время деления клеток в одном сперматоции, изображенном замедленной конфокальной микроскопией. Протоколы могут сочетаться с экспрессией любого количества флуоресцентно маркированных белков или маркеров органелл, а также генных мутаций и других генетических инструментов, что делает этот подход особенно мощным для анализа механизмов деления клеток в физиологическом контексте целых тканей и органов.

Introduction

Разделение клеток часто изучается с помощью клеточных линий, выращенных в культуре¹. Хотя мы получили богатство бесценного понимания и понимания фундаментальных механизмов из этих исследований², клетки, выращенные в культуре не может полностью резюмировать физиологии деления клеток, как это происходит в нетронутой, живой ткани. Например, в нетронутых тканей и органов, клетки должны делиться в нужном месте и в нужное время, так что потомство клетки должным образом расположены в ткани, так что они могут пройти соответствующую дифференциацию или функциональные программы, и так, что пролиферация клеток правильно координируется с ростом тканей или гомеостаза³. Для клеток, выращенных в культуре, с другой стороны, деление клеток, как правило, регулируется факторами роста в культуре среды⁴, и, таким образом, мы не можем узнать из этих клеток, как in vivo экологических факторов, таких как архитектура тканей или развития сигнализации влияние процесса деления. Важно также отметить, что многие из клеточных линий, используемых для изучения деления клеток, таких как Клетки HeLa и U2OS, были получены из метастатических опухолей^5. Таким образом, многие аспекты основной физиологии этих раковых клеток, такие как механизмы регулирования клеточного цикла и хромосомной стабильности, вероятно, были изменены по сравнению со здоровыми клетками. Полное понимание физиологии клеточного деления, таким образом, зависит от нашей способности изучать деленительные клетки в их родной, в виво-среде, которые сохраняют физиологические регуляторные механизмы и архитектуру тканей.

Достижениям в понимании того, как деление клеток действует в нетронутых тканях и органах, препятствуют трудности, присущие анализу in vivo или ex vivo. Во-первых, это может быть трудно или невозможно получить доступ к деления клеток для микроскопического анализа в крупных органах или толстых тканей. Во-вторых, часто трудно предсказать, когда отдельные клетки будут делиться в vivo. В-третьих, физиология тканей может быстро ухудшаться во время культуры ex vivo. В этом протоколе мы описываем легко доступные методы для живого и фиксированного анализа дрозофилы меланогастер сперматозитов, как они проходят meiotic клеточных делений в полностью нетронутыми яичками. Эти клетки идеально подходят для живого, экс-виво-анализа, потому что они легко доступны со стандартными оптическими методами, такими как конфокальная микроскопия, они делятся в предсказуемое время и места, и нетронутыми яичками могут быть сохранены в культуре ex vivo до около 24 ч. Кроме того, дрозофилы сперматозиты большие круглые клетки (примерно 20-30 мкм в диаметре), которые не меняют форму, когда они делятся, что делает их идеальными для высокого разрешения, замедленного изображения клеточных компонентов, таких как шпиндельный аппарат и цитоплазматические органеллы. Хотя эти клетки проходят мейоз в отличие от митоза, многие из основных процессов деления клеток очень похожи между этими двумя механизмами деления клеток^6. Эти преимущества, в сочетании с мощными drosophila генетических инструментов, сделали Drosophila сперматоцитов широко используется модель для анализа ex vivo основных процессов деления клеток, включая образование шпинделя и регулирование, цитокинез, и органеллы ремоделирования и секционирования^7,,99,10,11.

Сперматоциты являются клетки, которые находятся на мейотической стадии сперматогенеза. В Drosophila, сперматогенез начинается с группой зародышевых стволовых клеток, которые расположены в небольшой области или “хаб” на одном полюсе яичка^12,13. Эти клетки делятся на асимметричный митоз, что приводит к одному дифференцированному сперматогоногу. Сперматогония затем проходят четыре синхронных митозы для производства группы из 16 клеток, которые остаются тесно связаны в одной кисты. На этом этапе клетки переходят от митотического к мейотическому клеточному циклу и называются сперматоцитами. Сперматоциты проводят около двух-трех дней в расширенной стадии G2 клеточного цикла, во время которого они резко растут и претерпевают цитологические изменения в подготовке к двум мейотическим делениям и последующем спермиогенезу^13,14. Вся группа из 16 сперматозитов в пределах одной кисты затем ввести первый мейотического деления в то же время. Таким образом, несколько мейотических сперматозитов могут быть изображены одновременно, как они проходят через деление клеток. Первое meiotic разделение продолжает сярвые для приблизительно 1.5 h и последовано за почти немедленно вторым meiotic разделением, принося 64 полные сперматидов которые идут дальше продифференцировать в возмужалые spermatozoa.

Уникальное преимущество использования сперматозитов для изучения деления клеток в живой, нетронутой ткани является то, что группы или кисты клеток постоянно прогрессируют через различные стадии сперматогенеза, и клетки на всех стадиях сперматогенеза обычно могут быть определены в любой данный яичка (см. Рисунок 3A). Таким образом, это относительно легко найти мейотических клеток в целых яичках. Как правило, мы фокусируем наш анализ на первом, а не на втором мейозе, потому что эти клетки гораздо больше и более поддаются изображению с высоким разрешением, но весь процесс, охватывающий оба мейотических деления, может быть успешно отображен. Следует также отметить, что общий протокол для подготовки тести и культуры могут быть использованы для анализа других процессов сперматогенеза, а также, таких, как ранее митотических стволовых клеток или сперматогонических подразделений или цитологические изменения, которые происходят, как сперматозоиды созревают в сперматозоид¹⁵. Многие из этих аспектов сперматогенеза очень сохраняются между Дрозофилой и людьми¹⁶.

Дрозофилы сперматоцитов начинают достигать мейотической фазы сперматогенеза во время третьей стадии личинок в звезде развития Drosophila ¹³. Таким образом, яички, изолированные от стадий жизненного цикла, начиная с третьей личинок в звезде и в том числе куски и взрослые могут быть использованы для анализа деления сперматоций. Несколько отличных протоколов доступны для извлечения яичек из взрослых самцов мух для живого и фиксированного анализа сперматогенеза^17,,18,,19. Эти протоколы могут быть предпочтительнее для изучения поздних стадиях сперматогенеза или, если генетические маркеры, которые видны только у взрослых должны быть использованы. Протокол фокусируется вместо этого на подготовке тести из личинок и ранних куколок, потому что яички на этих стадиях имеют несколько преимуществ, которые имеют непосредственное отношение к анализу деления клеток с высоким разрешением, замедленной микроскопией. Во-первых, яички от личинок и куски меньше, чем у взрослых, и клетки в органе менее переполнены. Из-за этого, деление сперматоцитов часто можно изображением вблизи внешней поверхности личиночных яичек, без необходимости проникать через несколько слоев светосеющих тканей. Во-вторых, взрослые яички двигаются ритмично из-за сокращений прикрепленных органов аксессуаров, и эти движения делают замедленное изображение отдельных клеток сложной задачей. И в-третьих, личинок яички являются выгодными при изучении генных мутаций, которые вызывают pupal или взрослых летальности. Наши методы оптимизированы для долгосрочной культуры яичек на стадии микроскопа, что позволяет для визуализации нескольких раундов деления клеток или прогрессирования отдельных клеток через несколько стадий сперматогенеза в том же препарате. Мы также описываем протокол фиксации и иммуностоинга целых яичек. В целом, наши протоколы особенно полезны для тех, кто заинтересован в изучении деления клеток в нетронутой ткани, и способность сочетать анализ сперматозитов с высокоуступчивыми генетическими инструментами Drosophila делает это особенно мощным подходом.

Protocol

1. Подготовка животных, инструментов и средств массовой информации для вскрытия Крест мужчины и женщины мух, чтобы получить потомство желаемого генотипа. Полезные трансгенные маркеры для идентификации и постановки мейотических сперматозитов включают GFP-тубулин для обозначения м…

Representative Results

Когда этот протокол будет успешно выполнен, яички останутся полностью нетронутыми для визуализации с помощью конфокальной микроскопии или других методов флуоресценции микроскопии. Как видно на рисунке 3A, клеточная организация яичек сохраняется, и прогрессирование кл…

Discussion

Мы описали протокол для подготовки личинок или ранних яичек pupal Drosophila, оптимизированный для долгосрочной, живой визуализации деления клеток сперматоцитов. Это мощный метод анализа деления клеток в физиологическом контексте нетронутой ткани. Сила этого метода еще больше расширяе?…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium