生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製
Summary
このプロトコルの目的は、ショウジョウバエの精細細胞を用いた細胞顕微鏡と固定細胞顕微鏡法により、無傷組織における細胞分裂を解析することである。このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫と初期の子犬から全体の無傷の精巣を分離する方法と、顕微鏡検査のためにそれらを処理し、マウントする方法を示しています。
Abstract
細胞分裂が発達、組織恒常性、疾患プロセスとどのように統合されているかを理解するには、生きている、無傷の組織および器官で分裂する細胞の実験的分析が不可欠である。梅毒を受けているショウジョウバエ精子細胞は、(1)精子細胞を含むショウジョウバエ精巣全体が顕微鏡の準備が比較的容易であり、(2)精子細胞の大きなサイズは高解像度イメージングに適しており、(3)強力なショウジョフィラ遺伝ツールを生体内分析と統合することができるため、この分析に最適です。ここでは、ショウジョウバエ第3インスター幼虫および早期の子犬からの精巣全体の調製のための容易にアクセス可能なプロトコルを提示する。精巣全体で大腸精子細胞を同定する方法と、タイムラプス顕微鏡で生きている様子を画像化する方法について説明する。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルも提供される。幼虫精巣の使用は、精子細胞分析のために成人精巣を使用する利用可能なプロトコルよりもいくつかの利点があります。最も重要なことは、幼虫精巣は成人精巣よりも小さく、細胞で混雑が少なく、これは精子細胞の高解像度イメージングを大幅に促進する。これらの利点およびプロトコルの応用を実証するために、時間経過共焦点顕微鏡で画像化された単一の精子細胞における細胞分裂中の紡錘微小管に対する小胞細管の再分配を示す結果を提示する。このプロトコルは、蛍光タグ付きタンパク質やオルガネラマーカー、遺伝子変異、その他の遺伝的ツールの発現と組み合わせることで、組織および器官全体の生理学的文脈における細胞分裂機構の分析に特に強力です。
Introduction
細胞分裂は、培養1で増殖した細胞株を用いて研究されることが多い。これらの研究2から、我々は、これらの研究から、基本的なメカニズムの豊富な洞察力と理解を得ているが、培養で成長した細胞は、それが無傷の、生体組織で起こる細胞分裂の生理学を完全に再現することはできません。例えば、無傷の組織や臓器では、細胞は、子孫細胞が組織内に適切に位置するように適切な場所と適切なタイミングで分裂しなければならず、適切な分化または機能的プログラムを受けることができ、細胞増殖が組織の成長または恒常性3と適切に調整されるようにする。一方、培養で増殖した細胞については、細胞分裂は一般に培地4の成長因子によって調節されるため、生体内の環境因子(組織アーキテクチャや発育シグナル伝達など)が分裂過程にどのような影響を与えるかをこれらの細胞から学ぶことはできない。また、HeLaやU2OS細胞などの細胞分裂を研究するために使用される細胞株の多くは、転移性腫瘍5に由来していたことに注意することも重要である。したがって、これらの癌細胞の基礎生理学の多くの側面は、細胞周期調節機構および染色体安定性など、健康な細胞と比較して改変された可能性が高い。したがって、細胞分裂生理学の完全な理解は、生理学的調節機構および組織アーキテクチャを維持する生体環境における分裂細胞を研究する能力に依存する。
細胞分裂が無傷の組織や臓器内でどのように機能するかを理解する上での進歩は、生体内またはエクスビボ分析に固有の困難によって妨げられます。まず、大きな臓器や厚い組織内の顕微鏡分析のために分割細胞にアクセスすることは困難または不可能です。第二に、個々の細胞が生体内でいつ分裂するかを予測することはしばしば困難である。第3に、組織生理学は、元の生体培養中に急速に悪化する可能性がある。このプロトコルでは、完全に無傷の精巣内で細胞分裂を受けるショウジョウバエメラノガスター精子細胞の生きた固定分析のための容易にアクセス可能な方法について説明する。これらの細胞は、共焦点顕微鏡などの標準的な光学方法で容易にアクセス可能であり、予測可能な時間と場所で分裂し、無傷の精巣を約24時間までex vivo培養で維持できるため、生きているex vivo分析に最適です。さらに、ショウジョウバエ精子細胞は、分裂しても形が変わらない大きな丸い細胞(直径約20~30μm)であり、スピンドル装置や細胞質小器官などの細胞成分の高解像度、タイムラプスイメージングに最適です。これらの細胞は有糸分裂とは対照的に分裂を起こしますが、必須の細胞分裂プロセスの多くは、これら2つの細胞分裂機構6の間で非常に類似しています。これらの利点は、強力なショウジョウバエの遺伝的ツールと組み合わせることで、ショウジョウバエ精子細胞を紡錘形成および調節、サイトカネシス、および小器官改修および仕切り77、8、9、10、118,9,10,を含む必須細胞分裂プロセスのex vivo分析のために広く使用されるモデルにした。11
精子細胞は、精子形成の大精期にある細胞である。ショウジョウバエでは、精巣12,13,の1極に小さな領域または「ハブ」に位置する生殖細胞幹細胞群から精子形成が始まる。これらの細胞は非対称の有糸分裂によって分裂し、単一の分化された精子を生じさせる。精子は、その後、単一の嚢胞内に密接に関連付けられたままの16個の細胞のグループを生成するために4つの同期マイトースを受ける。この段階では、細胞は有糸分裂性から大細胞周期に移行し、精子細胞と呼ばれる。精子細胞は、細胞周期の拡張G2段階で約2〜3日間を過ごし、その間に劇的に成長し、2つの細分分裂とその後の精子形成13、14,14に対する準備において細胞学的変化を受ける。単一の嚢胞内の16個の精子細胞のグループ全体が同時に最初の大腸分裂に入る。したがって、いくつかのメオティック精子細胞は、細胞分裂を進める間同時に画像化することができる。最初の大腸分裂は約1.5時間進行し、ほぼ即座に第2の大腸分裂が続き、成熟した精子に分化するために進む64の総精子が得られる。
精子細胞を使用して生きている無傷の組織で細胞分裂を研究するユニークな利点は、細胞のグループまたは嚢胞が精子形成の異なる段階を経て絶えず進行し、精子形成のすべての段階の細胞が通常任意の精巣で同定できることである(図3Aを参照)。したがって、精巣全体で大腸細胞を見つけることは比較的容易である。これらの細胞ははるかに大きく、高解像度イメージングに適しているため、第2の除細症とは対照的に、一般的に最初の分析に焦点を当てていますが、両方のmeiotic部門を含むプロセス全体を正常にイメージングすることができます。また、精巣の準備および培養のための一般的なプロトコルは、精子形成の他のプロセスを分析するためにも使用することができることに留意すべきである。15精子形成のこれらの側面の多くは、ショウジョウバエとヒト16の間で高度に保存されている。
ショウジョウバエ精子細胞は、ショウジョウバエ開発13の第3のインスター幼虫段階の間に精子形成のmeiotic段階に達し始める。したがって、第3のインスター幼虫から始まり、子犬と成人を含むライフサイクル段階から分離された精巣を、精子細胞の分裂の分析に使用することができる。いくつかの優れたプロトコルは、精子形成17、18、19,18,19の生きている、固定分析のために、成人男性ハエからの精巣の抽出のために利用可能である。これらのプロトコルは、精子形成の後期段階を研究するために好ましいかもしれないか、または成人にのみ目に見える遺伝マーカーを使用しなければならない場合。これらの段階での精巣は、高解像度、タイムラプス顕微鏡による細胞分裂解析に特に関連するいくつかの利点を有するため、このプロトコルは、幼虫および早期の子犬からの精巣調製に焦点を当てる。まず、幼虫や子犬の精巣は成人の精巣よりも小さく、臓器内の細胞は混雑が少ない。このため、精子を分割することは、多くの場合、光散乱組織の複数の層を貫通することなく、幼虫精巣の外表面の近くで画像化することができます。第二に、成体精巣は付属の付属器官の収縮のためにリズミカルに動き、これらの動きは個々の細胞のタイムラプスイメージングを困難にする。第三に、幼虫精巣は、プパルまたは成人の致死を引き起こす遺伝子変異を研究する際に有利である。我々の方法は、顕微鏡段階で精巣の長期培養のために最適化され、同じ調製物中の精子形成の複数段階を通して細胞分裂の複数のラウンドまたは個々の細胞の進行のイメージングを可能にする。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルについても述べている。全体として、私たちのプロトコルは、無傷の組織における細胞分裂を研究することに興味がある人にとって特に有用であり、精子細胞分析と非常に難解なショウジョウバエ遺伝ツールを組み合わせる能力は、これを特に強力なアプローチにします。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、精子細胞分裂の長期的な、生画像化のために最適化された幼虫または初期の小児性ショウジョウバエ精巣の調製のためのプロトコルを説明した。これは、無傷の組織の生理的文脈における細胞分裂の分析のための強力な方法である。この方法のパワーは、特定の遺伝子変異、組織特異的RNAi媒介抑制、および蛍光標識タンパク質およびオルガネラマーカーなどのショウジョ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、J.T.S.への国防総省のスタートアップ資金によって支援されました。
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
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