Summary

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Published: May 19, 2020
doi:

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

Abstract

ניתוח ניסיוני של תאים חילוק בחיים, רקמות ואיברים שלמים הוא חיוני להבנת איך חלוקת התא משתלב עם פיתוח, רקמות הומאוסטזיס, ותהליכי מחלות. דרוזופילה ספרמטוציטים שעוברים מיוזיס הם אידיאליים עבור ניתוח זה, כי (1) כל drosophila האשכים המכילים spermatocytes קל יחסית להתכונן למיקרוסקופיה, (2) בגודל גדול של הספרציטים הופך אותם מתאימים היטב לדימות ברזולוציה גבוהה, ו (3) הכלים הגנטיים של drosophila יכול להיות משולב כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיש בקלות להכנת האשכים שלמים מדרוזוהילה הזחלים השלישי והגלמים המוקדמים. אנו מתארים כיצד לזהות ספרמטציטים מיוטיות בתוך האשכים המוכנים וכיצד לדמות אותם חיים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. פרוטוקולים עבור קיבוע והכתים האשכים שלם מסופקים גם. השימוש האשכים זחל יש מספר יתרונות על פרוטוקולים זמינים המשתמשים באשכים מבוגרים לניתוח spermatocyte. החשוב ביותר, האשכים זחל הם קטנים פחות צפוף עם תאים מאשר האשכים למבוגרים, וזה מאפשר מאוד הדמיה ברזולוציה גבוהה של spermatocytes. כדי להדגים את היתרונות הללו ואת היישומים של הפרוטוקולים, אנו מציגים את התוצאות המציגות את ההפצה משנה של הרשת האנדופלזמית לגבי מיקרוטובוקלס במהלך חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ בודד שנוצר על-ידי מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. הפרוטוקולים יכולים להיות משולבים עם הביטוי של כל מספר של חלבונים מתויגים fluorescently או סמנים ארגונית, כמו גם מוטציות גנטיות וכלים גנטיים אחרים, מה שהופך גישה זו חזק במיוחד עבור ניתוח של מנגנוני חלוקת התא בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים שלמים.

Introduction

חלוקת התא לומדת לעתים קרובות באמצעות קווי תאים הגדלים בתרבות1. למרות שרכשנו שפע של תובנה והבנה לא יסולא בפז של מנגנונים בסיסיים ממחקרים אלה2, תאים שגדלו בתרבות לא יכולים ללכוד באופן מלא את הפיזיולוגיה של חלוקת התא כפי שהוא מתרחש ברקמה חיה שלמה. לדוגמה, ברקמות ובאיברים שלמים, התאים חייבים להתחלק במקום הנכון ובזמן הנכון כך שתאים צאצאים ממוקמים כראוי בתוך הרקמה, כך שהם יכולים לעבור בידול מתאים או תוכניות פונקציונלי, ולכן התפשטות התא מתואמת כראוי עם צמיחה רקמות או הומאוסטזיס3. עבור תאים שגדלו בתרבות מצד שני, החטיבה התא מוסדר בדרך כלל על ידי גורמי גדילה במדיום התרבות4, ולכן אנחנו לא יכולים ללמוד מתאים אלה איך בvivo גורמים סביבתיים כגון אדריכלות רקמות או איתות התפתחותי להשפיע על תהליך החלוקה. חשוב גם לציין כי רבים של קווי התא המשמשים לחקר חלוקת התא, כגון התאים הלה ו U2OS, נגזר גידולים גרורתי5. לכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה הבסיסית של תאים אלה סרטניים, כגון מנגנוני הרגולציה מחזור התא ויציבות כרומוזומלית, סביר להניח ששונו לעומת תאים בריאים. הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של חלוקת התא, לפיכך, תלויה ביכולתנו ללמוד את התאים המקוריים שלהם, בסביבות vivo השימור מנגנונים פיזיולוגיים וארכיטקטורת רקמות.

ההתקדמות בהבנת האופן שבו חטיבת התאים פועלת בתוך רקמות ואברים שלמים, מתקשים בvivo או בניתוח vivo לשעבר. ראשית, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי כדי לגשת מחלוקת תאים לניתוח מיקרוסקופי בתוך איברים גדולים או עבה רקמות. שנית, קשה לעתים קרובות לנבא כאשר תאים בודדים מתחלקים בvivo. שלישית, פיזיולוגיה של רקמות עלולה להתדרדר במהירות במהלך התרבות הvivo לשעבר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות נגישות בקלות לניתוח בשידור חי וקבוע של דרוסופילה מלאנומנוציטים בזמן שהם עוברים מחלקות תאים מיוטיות בתוך האשכים שלמים לחלוטין. תאים אלה הם אידיאליים עבור לחיות, לשעבר ניתוח vivo כי הם נגישים בקלות עם שיטות אופטיות סטנדרטיות כגון קונפוקלית מיקרוסקופ, הם מתחלקים בזמנים צפויים ומיקומים, ואת האשכים שלמים ניתן לשמור בתרבות לשעבר vivo עד כ 24 h. בנוסף, דרוזופילה ספרציטים הם תאים עגולים גדולים (כ -20-30 יקרומטר בקוטר) שאינם משנים צורה כאשר הם מתחלקים, והופכים אותם לאידיאליים ברזולוציה גבוהה, הדמיה של מרכיבי הסלולר כגון מנגנון הצירים והאורגלים הציטוטיים. למרות תאים אלה עוברים מיוזה לעומת mitosis, רבים של התהליכים החיוניים החטיבה התא דומים מאוד בין שני אלה מנגנוני חלוקת התא6. יתרונות אלה, בשילוב עם כלים גנטיים בעלי עוצמה דרוזוהילה , עשו דרוזוהילה ספרמטציטים בשימוש נרחב בדגם vivo ex של תהליכים של חטיבת תאים חיוניים, כולל היווצרות צירים ורגולציה, ציטוקינזה, ושיפוץ ארגונית וחלוקה למחיצות7,8,9,10,11.

הספרציטים הם תאים הנמצאים בשלב המיוטיסטי של זרע. בדרוזופילה, מתחילה הזרע עם קבוצה של תאי גזע של germline הממוקמים באזור קטן או “hub” בעמוד אחד של ה-12,13. תאים אלה מתחלקים על ידי מיטוזיס אסימטרית, ומעניק הרבה spermatogonium אחד הבדיל. הזרע לאחר מכן לעבור ארבעה mitoses סינכרוני כדי לייצר קבוצה של 16 תאים שנותרו קשורים היטב בתוך ציסטה אחת. בשלב זה, התאים מעבר מmitotic למחזור התא meiotic ומכונים spermatocytes. Spermatocytes לבלות שניים עד שלושה ימים בשלב מורחב G2 של מחזור התא, במהלכו הם גדלים באופן דרמטי ולעבור שינויים ציטולוגיים בהכנה עבור שתי חטיבות meiotic ו spermiogenesis הבאים13,14. הקבוצה כולה של 16 spermatocytes בתוך ציסטה אחת ולאחר מכן להיכנס החלוקה meiotic הראשון באותו זמן. לפיכך, ניתן לבצע יצירת תמונות של מספר ספרציטים במקביל כשהם ממשיכים דרך מחלקת התאים. החטיבה meiotic הראשון ההכנסות עבור כ 1.5 h והוא עקב כמעט מיד על ידי החטיבה השנייה meiotic, מניב 64 הכולל הכוללת כי להמשיך להבדיל לתוך הזרע בוגרת.

היתרון הייחודי של שימוש בספרציטים כדי ללמוד החטיבה התא בחיים, רקמה שלמה היא כי קבוצות או ציסטות של תאים התקדמות מתמדת דרך בשלבים שונים של הזרע, ותאים בכל שלבי הזרע ניתן בדרך כלל להיות מזוהה בכל בעיות נתון (ראה איור 3A). לכן, קל יחסית למצוא תאים meiotic באשכים שלמים. אנחנו בדרך כלל למקד את הניתוחים שלנו על הראשון לעומת מיוזה השני משום תאים אלה הם הרבה יותר גדול ומקובל יותר הדמיה ברזולוציה גבוהה, אבל התהליך כולו המקיף הן מחלקות מיוזה ניתן לבצע דימות בהצלחה. יצוין גם כי הפרוטוקול הכללי לקראת הכנה ותרבות ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים אחרים של הזרע כמו גם, כגון תא הגזע הקודם mitotic או מחלקות spermatogonial או שינויים ציטולוגיים המתרחשים כמו זכותנו מבוגרים לתוך הזרע15. רבים מן ההיבטים הללו של הזרע נשמרים במידה רבה בין דרוזוהילה לבני אדם16.

דרוזוהפילה ספרציטים מתחיל להגיע לשלב המיוסטי של הזרע במהלך הזחל השלישי של דרוזוהילה לפיתוח13. לפיכך, האשכים מבודדים משלבי מחזור חיים המתחילים בזחלים שלישיים ובכללם גלמים ומבוגרים יכולים לשמש לניתוח של חלוקת ספרציטים. פרוטוקולים מצוינים מספר זמינים עבור חילוץ של האשכים של גברים בוגרים זבובים לניתוח חי וקבוע של זרע בראשית17,18,19. פרוטוקולים אלה עשויים להיות עדיפים ללמוד בשלבים מאוחרים של הזרע או אם סמנים גנטיים הגלויים רק אצל מבוגרים יש להשתמש. הפרוטוקול מתמקד בהכנה של בדיקת הרימות והגלמים המוקדמים, משום שלאשכים בשלבים אלה יש מספר יתרונות הרלוונטיים במיוחד לניתוח של חלוקת תאים ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ בזמן הקפיצה. ראשית, האשכים של הזחלים והגלמים קטנים יותר מאלה של מבוגרים, והתאים בתוך האיבר הם פחות צפוף. בגלל זה, חלוקת הספרציטים יכולה לעתים קרובות להיות בתמונה ליד המשטח החיצוני של האשכים זחל, מבלי לחדור דרך שכבות מרובות של רקמת פיזור אור. שנית, האשכים מבוגרים לזוז בקצב בשל התכווצויות של אברי האביזר המצורף, ותנועות אלה להפוך זמן לפקיעה הדמיה של תאים בודדים מאתגרת. ושלישית, האשכים הזחל הם יתרון כאשר לומדים מוטציות גנים הגורמות גולמי או מבוגרים השפעה. השיטות שלנו ממוטבת לתרבות ארוכת טווח של האשכים על הבמה המיקרוסקופ, המאפשר דימות של סיבובים מרובים של חלוקת התא או התקדמות של תאים בודדים באמצעות שלבים מרובים של הזרע באותו הכנה. אנו מתארים גם פרוטוקול עבור קיבוע וכתמים חיסוני של האשכים שלמים. בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו שימושיים במיוחד עבור אלה המעוניינים ללמוד חלוקת תאים ברקמה שלמה, ואת היכולת לשלב ניתוח spermatocyte עם מאוד צייתן הכלים הגנטיים הופך את זה גישה חזקה במיוחד.

Protocol

1. הכנת בעלי חיים, כלים ומדיה לחיתוך להצליב זבובים זכר ונקבה כדי להשיג צאצאים של גנוטיפ הרצוי. סמנים הטרנסגניים שימושיים לזיהוי ואחסון זמני של הספרציטים כוללים GFP-טובולין כדי לתייג את ציר meiotic ו RFP-histone 2A כדי תווית כרומזומים8. השתמש חמש עד עשר נקבות לחצות ולשמור על צלבים על מ…

Representative Results

כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, האשכים יישארו שלמים לחלוטין לדימות על ידי מיקרוסקופ מוקד או שיטות אחרות מיקרוסקופ הזריחה. כפי שניתן לראות באיור 3a, הארגון הסלולר של האשכים נשמר, ואת ההתקדמות של בידול התא מקצה אחד של הפנים אל השני כולל הזרע, spermatציטים, ו פלואידי spermatids הוא גלוי. …

Discussion

תיארנו פרוטוקול להכנת זחל או גולמי מוקדם drosophila ילה האשכים, אופטימיזציה לטווח ארוך, לחיות הדמיה של מחלקת התא spermatocyte. זוהי שיטה רבת-עוצמה לניתוח חלוקת תאים בהקשר הפיזיולוגי של רקמות שלמות. העוצמה של שיטה זו מורחבת עוד יותר כאשר בשילוב עם כלים גנטיים דרוזוהילה , כגון מוטציות גנטיות ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מחלקת ההגנה הסטארט-up לJ.T.S.

Materials

5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. . Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).

Play Video

Cite This Article
Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

View Video