Summary

阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定,用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定

Published: March 29, 2020
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Summary

棕榈化需要以可逆的方式将16碳棕榈酰化物与靶蛋白的半胱氨酸残留物结合。在这里,我们描述了一种生化方法,即acyl-PEGyl交换凝胶移位(APEGS)测定,以研究小鼠脑水化剂中任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态。

Abstract

在脑后密度 (PSD) 中突触性 AMPA 受体 (AMPA) 水平的活动相关变化被认为是一种细胞机制的学习和记忆。棕榈化以活动相关的方式调节许多突触蛋白的定位和功能,包括AMPA-R、辅助因子和突触支架。我们确定了突触分化诱导基因(SynDIG)的四个基因系列(SynDIG1-4),编码与AmpARs关联并调节突触强度的特定于大脑的跨膜蛋白。SynDIG1 在位于并列跨膜区域位置 191 和 192 处的两个半胱氨酸残留物处进行棕榈酸酯化,对活动依赖性兴奋突触发育非常重要。在这里,我们描述了一种创新的生化方法,即acyl-PEGyl交换凝胶移位(APEGS)测定,以调查任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态,并证明其与小鼠脑水化中蛋白质的SynDIG家族的作用。

Introduction

S-掌上酸化是一种可逆的转化后靶蛋白,调节稳定的膜关联、蛋白质贩运和蛋白质-蛋白质相互作用1。它涉及通过棕榈酸乙酰乙酰转移酶(PAT)酶催化的硫化物链接,将16碳棕榈酸酶添加到半胱氨酸残留物中。大脑中的许多突触蛋白被棕榈酸化,包括AMPA-R和PSD-95,以活动依赖的方式调节稳定性、定位性和功能22,3,4。3,4通过辅助因素与突触支架(如 PSD-95)之间的相互作用,PSD 中突触性抗量系数水平的变化,导致突触可塑性;因此,确定突触蛋白的棕榈化状态的方法为突触可塑性机制提供了重要的见解。

之前,我们确定了SynDIG家族的四个基因(SynDIG1-4),编码与AmpARs5相关的大脑特异性跨膜蛋白。在分离的大鼠河马神经元中,SynDIG1的过度表达或击倒增加或减少,AMPA-R突触的大小和数量与使用免疫细胞化学和电生理学5检测到的+50%。我们利用acyl-生物素交换(ABE)测定法来证明SynDIG1在两种保存的共聚体-转膜细胞残留物(存在于所有SynDIG蛋白中)中,以活动相关的方式调节稳定性、定位性和功能6。ABE测定依赖于通过修饰和随后的亲和力纯化7保护的半胱氨酸的生物组。在这里,我们描述了一种创新的生化方法,acyl-PEGyl交换凝胶移位(APEGS)测定88,9,10,11,12,它不需要亲和力纯化,而是利用凝胶流动性的变化来确定感兴趣的蛋白质的修改次数。,9,10,11,12该协议被描述为研究小鼠大脑中的内源膜蛋白,适合其抗体。

Protocol

所有动物程序都遵循国家卫生研究院 (NIH) 制定的指导方针,并经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准。 1. 小鼠脑膜的制备 使用断头器将小鼠斩首,并迅速解剖大脑(如果可能,在+lt;1 分钟内,以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈岛化变化)。在冰上的玻璃均质器(+12冲程)中,在10 mL的均质缓冲液(表1)中立即均质化。 在4°…

Representative Results

与不包括HAM的样品相比,用抗体对感兴趣的蛋白质进行免疫膨胀,可以揭示小鼠脑解解液中的棕榈酸化状态(非、单独、双重等)。此前,我们已经证明SynDIG1是使用ABE测定6在两个地点进行棕榈酸盐测定的;然而,我们无法确定这两个位点是否在脑组织中被修改。在这里,我们显示,SynDIG1,SynDIG4/Prrt1,和Prrt2在小鼠大脑中被棕榈酸化,他们有两个潜在的棕…

Discussion

在之前的工作中,我们利用 ABE 测定来证明 SynDIG1 在两种保存的共聚膜细胞残渣(存在于所有 SynDIG 蛋白质中)中以活动相关的方式进行棕榈酸化,以调节稳定性、定位性和功能6。一个限制是ABE测定需要亲和纯化与阿甘丝树脂结合作为程序的最后一步,导致信号的重大丢失,使定量分析复杂化。此外,ABE测定无法区分蛋白质是棕榈酸酯一次还是在多个地点。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢K.Woolfrey对APEGS测定的建议和意见。这些研究由白厅基金会和NIH-NIMH(1R01MH119347)对E.D.的研究资助资助。

Materials

Hydroxylamine (HAM) ThermoFisher 26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) NOF ME-050MA MW ~5000 kDa
Microfuge Eppendorf 5415R or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM) Calbiochem 34115 Highly toxic.
Optical imager for densitometry Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imager or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap Fisher Scientific 14-956-1D
Serological pipets (glass) Fisher Scientific 13-678-27D
Table top centrifuge Beckman Allegra X-15R or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) EMD Millipore 580560

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Cite This Article
Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (157), e61018, doi:10.3791/61018 (2020).

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