Summary

Acyl-PEGyl Обмен Гель Сдвиг Анализ для количественного определения Palmitoylation мозга Membrane белков

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

Palmitoylation влечет за собой включение 16-углеродного пальмитата moiety к цистеину остатков целевых белков в обратимым образом. Здесь мы описываем биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка, интересующее в мышиных лизатах мозга.

Abstract

Считается, что изменения, зависящие от активности в уровнях синаптических рецепторов АМРА (АМРАР) в течение постсинаптической плотности (PSD), представляют собой клеточный механизм обучения и памяти. Palmitoylation регулирует локализацию и функцию многих синаптических белков, включая АМРА-Rs, вспомогательные факторы и синаптические леса в активности-зависимым образом. Мы определили синапсовую дифференциацию индуцированного гена (SynDIG) семейства из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами и регулируют силу синапсов. SynDIG1 является palmitoylated на двух остатков цистеина, расположенных на позициях 191 и 192 в регионе juxta-transmembrane важно для деятельности-зависимых возбуждания синапсов развития. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обменный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка интерес и продемонстрировать свою полезность с семейством SynDIG белков в мышиных мозговых лизатах.

Introduction

S-palmitoylation является обратимой пост-трансляционной модификации целевых белков, которая регулирует стабильную мембранную ассоциацию, торговлю белками и белково-белковые взаимодействия1. Она включает в себя добавление 16-углеродного пальмитата moiety к остаткам цистеина через тиостер связи катализировали palmitoyl acyltransferase (PAT) ферментов. Многие синаптические белки в головном мозге palmitoylated, в том числе АМРА-Rs и PSD-95, в активности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации, и функции2,3,4. Изменения в уровнях синаптической АМРАРов в PSD через взаимодействие вспомогательных факторов с синаптической эшафот, таких как PSD-95 лежит в основе синаптической пластичности; Таким образом, методы определения состояния пальмитоилации синаптических белков дают важное представление о механизмах синаптической пластичности.

Ранее мы определили семейство SynDIG из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами5. Переэкспрессия или нокдаун SynDIG1 в диссоциированных крысиных гиппокампальных нейронов увеличивается или уменьшается, соответственно, ampA-R размер синапса и число на 50%, как обнаружено с помощью иммуноцитохимии и электрофизиологии5. Мы использовали ацил-биотин обмена (ABE) анализ, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности зависимых образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. ABE ассси опирается на обмен биотина на цистеины защищены модификации и последующей очистки сродства7. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ8,9,10,11,12, который не требует очистки сродства и вместо этого использует изменения в подвижности геля, чтобы определить количество изменений для белка интерес. Протокол описан для исследования эндогенных мембранных белков из мозга мыши, для которых доступны подходящие антитела.

Protocol

Все процедуры для животных следовали руководящим принципам, установленным Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. 1. Подготовка мембран мозг…

Representative Results

Иммуноблоттинг с антителами против белка интереса показывает palmitoylated состояние (не, посредственный, вдвойне и т.д.) в мышиных мозговых лисатов, как определяется сдвиг мобильности по сравнению с образцами, в которых HAM не был включен. Ранее мы продемонстрировали, что SynDIG1…

Discussion

В нашей предыдущей работе, мы использовали анализ ABE, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 является palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. Огр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят К. Вулфри за советы и вклад в aPEGS. Эти исследования финансировались за счет научно-исследовательских грантов E.D. от Фонда Уайтхолла и NIH-NIMH (1R01MH19347).

Materials

Hydroxylamine (HAM) ThermoFisher 26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) NOF ME-050MA MW ~5000 kDa
Microfuge Eppendorf 5415R or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM) Calbiochem 34115 Highly toxic.
Optical imager for densitometry Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imager or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap Fisher Scientific 14-956-1D
Serological pipets (glass) Fisher Scientific 13-678-27D
Table top centrifuge Beckman Allegra X-15R or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) EMD Millipore 580560

References

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  14. . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Play Video

Cite This Article
Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (157), e61018, doi:10.3791/61018 (2020).

View Video