Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח
Summary
Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג’ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.
Abstract
שינויים תלויי-הפעילות ברמות קולטני הסינפטיות (AMPARs) בתוך צפיפות הפוסט-סינפטית (PSD) נחשבת לייצוג מנגנון הסלולר ללמידה ולזיכרון. Palmitoylation מסדיר את הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים סינפטיים רבים כולל אמפא-Rs, גורמי עזר ומקפלים סינפטיים באופן תלוי-פעילות. זיהינו את הסינפסה המושרה גן (syndig) משפחה של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים חלבון טראנסממברנלי השייך ampars ולווסת את הכוח סינפסה. SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות ציסטאין הממוקמים במיקום 191 ו 192 באזור juxta-טרנסקרום חשוב עבור פיתוח התפתחות הפעולה התלויית-סינפסה. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית ביוכימית, משמרת ג’ל החליפין של acyl-PEGyl (אפגס), כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין ולהדגים את כלי השירות שלה עם משפחת הסינדיג של חלבונים במוח העכבר lysates.
Introduction
S-palmitoylation הוא שינוי הפיך לאחר השינוי של חלבונים היעד המסדיר האיגוד קרום יציב, סחר בחלבונים, ואינטראקציות חלבונים חלבון1. זה כולל תוספת של 16-פחמן palmitate moiety כדי שאריות ציסטאין באמצעות הצמדה מזרז ההצמדה של palmitoyl (PAT) אנזימים. חלבונים סינפטית רבים במוח הם palmitoylated, כולל האמפא-Rs ו-PSD-95, באופן התלוי בפעילות כדי להסדיר את היציבות, הלוקליזציה והפונקציה2,3,4. שינויים ברמות הסינפטית של AMPARs ב-PSD באמצעות האינטראקציה של גורמי עזר עם הפיגומים הסינפטית כגון PSD-95 ביסוד הפלסטיות הסינפטית; לכן, שיטות לקבוע את מצב הפלמיטלציה של חלבונים סינפטית מספק תובנה חשובה למנגנונים של פלסטיות סינפטית.
בעבר, זיהינו את משפחת SynDIG של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים טרנסקרום הקשר עם AMPARs5. ביטוי יתר או להפיל את SynDIG1 בתוך היפואת הנוירונים ההיפוקמא היפוקרטס מגדילה או פוחתת, בהתאמה, מזהה ה-, מספר ה-הסינפסה-R ו-x ב-~ 50% כפי שזוהה באמצעות האימונוציטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה5. אנו מנוצל החליפין acyl-biotin (אייב) מאפשר להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות juxta-transממברני (נמצא בכל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. השיטת אייב מסתמכת על חילופי ביוטין על cysteines מוגן על ידי שינוי וטיהור אהדה הבאים7. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית חדשנית, שינוי החליפין של ה-acyl-pegyl (אפגס), הקובע8,9,10,11,12, שאינו דורש טיהור אהדה ובמקום זאת מנצל שינויים בניידות ג’ל כדי לקבוע את מספר השינויים עבור חלבון מעניין. הפרוטוקול מתואר לחקירה של חלבונים ממברנה אנדודוגני ממוח העכבר שעבורו נוגדנים מתאימים זמינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה הקודמת שלנו, אנו משתמשים באותו שיטת אייב כדי להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני משקעי juxta שימור ממברנה Cys (נמצא כל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. מגבלה היא כי שיטת אייב דורש טיהור אהדה עם שרפים agarose מצומת אבידין moieties כשלב הסופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לג וולפריי לקבלת ייעוץ וכניסה בנוגע לשיטת ה-אפגס. מחקרים אלה היו ממומנים על ידי מענקי מחקר כדי E.D. מן הקרן וייטהול ו NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
