Summary

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

Published: March 29, 2020
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Summary

パルミトイル化は、16炭素パルミチン酸部分を、可逆的に標的タンパク質のシステイン残基に取り込む必要があります。ここでは、生化学的アプローチ、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、マウス脳ライセートに関心のある任意のタンパク質のパルミトイル化状態を調べる。

Abstract

シナプス後密度(PSD)内のシナプスAMPA受容体(AMPA)のレベルにおける活動依存的変化は、学習および記憶のための細胞メカニズムを表していると考えられている。パルミトイル化は、AMPA-Rs、補助因子、シナプス足場を含む多くのシナプスタンパク質の局在化と機能を活動依存的に調節します。我々は、AMPAに関連付け、シナプス強度を調節する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)のシナプス分化誘導遺伝子(SynDIG)ファミリーを同定した。SynDIG1は、活性依存性励起シナプスの発達に重要な並置膜貫通領域の位置191および192に位置する2つのシステイン残基でパルミトレート化される。ここでは、革新的な生化学的アプローチであるアシルPEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、目的のタンパク質のパルミトリューション状態を調査し、マウス脳リセート中のSynDIGファミリーのタンパク質との有用性を実証する。

Introduction

S-パルミトリューションは、安定した膜会合、タンパク質の密売、およびタンパク質とタンパク質相互作用を調節する標的タンパク質の可逆的な翻訳後修飾である。パルミトイルアシルトランスセファーゼ(PAT)酵素によって触媒チオエステルリンケージを介してシステイン残基に16-炭素パルミチン酸部分を添加することを含む。脳内の多くのシナプスタンパク質は、安定性、局在化,、および機能,2、3、4を調節する活動依存的な方法で、AMPA-RsおよびPSD-95を含むパルミトレート化される。24PSD-95のようなシナプス足場との補助因子の相互作用によるPSD中のシナプスAMPプラスチックのレベルの変化は、シナプス可塑性を下にしている。したがって、シナプスタンパク質のパルミトイル化状態を決定する方法は、シナプス可塑性のメカニズムに関する重要な洞察を提供する。

以前は、AMPA5と関連する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)の5SynDIGファミリーを同定した。解約されたラット海馬ニューロンにおけるSynDIG1の過剰発現またはノックダウンは、それぞれ増加または減少し、AMPA-Rシナプスサイズおよび数は免疫細胞化学および電気生理学用いて検出された〜50%ずつ増加または減少する。我々は、アシルビオチン交換(ABE)アッセイを利用して、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(全SynDIGタンパク質に見られる)でパルミトレートされ、安定性、局在化、機能6を調節する活性依存的な方法で実証した。ABEアッセイは、改変とその後の親和性精製によって保護されたシステインに対するビオチンの交換に依存する7。ここでは、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ,88、9、10、11、1210,11という革新的な生化学的アプローチについて説明します。,912プロトコルは、適切な抗体が利用可能なマウス脳からの内因性膜タンパク質の調査のために記述されている。

Protocol

すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)が定めたガイドラインに従い、カリフォルニア大学デービス校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。 1. マウス脳膜の調製 ギロチン装置を使用してマウスの首を切り落とし、脳を急速に解剖する(可能であれば、解剖中に起こり得るパルミトイル化の変化を最小限に抑えるために、可能であれば、…

Representative Results

目的のタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングは、HAMが含まれていないサンプルと比較して移動性シフトによって決定されるマウス脳ライゼにおけるパルミトレート状態(非、独り、二重など)を明らかにする。以前は、SynDIG1がABEアッセイ6を用いて2つのサイトでパルミトレートされていることを実証しました。しかし、両方の部位が脳?…

Discussion

前の研究では、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(すべてのSynDIGタンパク質に見られる)で、安定性、局在化、機能調節する活性依存的な方法でパルミトレートされていることを実証するためにABEアッセイを利用しました。制限は、ABEアッセイは、手順の最終ステップとしてアビジン部分に結合したアガロース樹脂との親和性精製を必要とし、定量分析を複雑にするシ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、APEGSアッセイに関するアドバイスとインプットをK.ウールフリーに感謝する。これらの研究は、ホワイトホール財団とNIH-NIMH(1R01MH119347)からE.D.への研究助成金によって資金提供されました。

Materials

Hydroxylamine (HAM) ThermoFisher 26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) NOF ME-050MA MW ~5000 kDa
Microfuge Eppendorf 5415R or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM) Calbiochem 34115 Highly toxic.
Optical imager for densitometry Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imager or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap Fisher Scientific 14-956-1D
Serological pipets (glass) Fisher Scientific 13-678-27D
Table top centrifuge Beckman Allegra X-15R or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) EMD Millipore 580560

References

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Cite This Article
Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (157), e61018, doi:10.3791/61018 (2020).

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