Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

Summary

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Abstract

De neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) is een potentieel hulpmiddel om de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese op te helderen en mogelijk te helpen bij regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitroopgezet, met behulp van de strategie van combinatorische screening. Onder de hier gedefinieerde omstandigheden maakt het 2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daags retinoïnezuurinductieprotocol een snelle en efficiënte differentiatie van mESCs in neurale precursorcellen (NPC’s) mogelijk, zoals blijkt uit de vorming van goed gestapelde en neurietachtige A2lox en 129 derivaten die Nestine-positief zijn. De gezonde toestand van embryonale lichamen en het tijdstip waarop retinoïnezuur (RA) wordt toegepast, evenals de RA-concentraties, zijn daarbij van cruciaal belang. In de daaropvolgende differentiatie van NPC’s in neuronen zou N2B27 medium II (aangevuld met Neurobasal medium) het onderhoud en de rijping van neuronale cellen op lange termijn beter kunnen ondersteunen. De gepresenteerde methode is zeer efficiënt, goedkoop en eenvoudig te bedienen en kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.

Introduction

Embryonale stamcellen (ECC’s) zijn pluripotent en kunnen zich onder bepaalde omstandigheden onderscheiden in neurale precursorcellen (NPC’s) en vervolgens in neuronen¹. ESC-gebaseerde neurogenese biedt het beste platform om neurogenese na te bootsen, en dient zo als een nuttig hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologische studies en mogelijk hulp bij regeneratieve geneeskunde^2,3. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën gerapporteerd voor het induceren van embryonale neurogenese, zoals de transgene methode⁴, met behulp van kleine^{moleculen 5}, met behulp van een 3D-matrix micromilieu⁶, en de co-cultuurtechniek⁷. De meeste van deze protocollen zijn echter beperkt of moeilijk te bedienen, dus ze zijn niet geschikt voor gebruik in de meeste laboratoria.

Om een eenvoudig te bedienen en goedkope methode te vinden om efficiënte neurale differentiatie van mESCs te bereiken, werd hier een combinatorische screeningstrategie gebruikt. Zoals beschreven in figuur 1,was het hele proces van embryonale neurogenese verdeeld in 2 fasen. Fase I verwijst naar het differentiatieproces van mESC’s naar NPC’s, en fase II heeft betrekking op de daaropvolgende differentiatie van NPC’s in neuronen. Op basis van de principes van eenvoudige bediening, lage kosten, gemakkelijk beschikbare materialen en een hoge differentiatie-efficiëntie, werden zeven protocollen in fase I en drie protocollen in fase II gekozen op basis van het traditionele aanhankelijke monolaagcultuursysteem of embryooïde lichaamsvormingssysteem^8,9. De differentiatie-efficiëntie van protocollen in beide fasen werd geëvalueerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest. Door het meest efficiënte protocol van elke fase te combineren, hebben we de geoptimaliseerde methode voor neurale differentiatie van mESCs vastgesteld.

Protocol

1. Muis embryonale stamcelcultuur Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekgerechten of borden. Voeg 2 ml gesteriliseerde 0,1% gelatine (0,1% w/v in water) toe aan 60 mm celkweekschalen. Rock zachtjes om een gelijkmatige coating van de celcultuurgerechten te garanderen. Doe de borden in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C en laat 1 uur coaten. Verwijder de 0,1% gelatineoplossing voordat u de cellen zaait.OPMERKING: Na het verwijderen van de gelatine is het niet nodig om …

Representative Results

2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daagse RA-inductie werkt het beste bij het sturen van de differentiatie van mESC’s naar NPC’s (fase I). Om het optimale protocol te bepalen dat de differentiatie van mESCs in NPC’s (Fase I) het beste bevordert, werden 7 protocollen getest op zowel A2lox als 129 mESCs (tabel 1) en werd de differentiatiestatus van elke groep gecontroleerd met behulp van een lichtmicroscoop. Zoals getoond in figuur 3A, vertoonden de meeste A2lox en 129 der…

Discussion

In deze studie hebben we een eenvoudige en effectieve methode voor neuronale differentiatie van mESCs vastgesteld, met lage kosten en gemakkelijk te verkrijgen materialen. Bij deze methode kunnen 2 dagen embryoide lichaamsvorming gevolgd door 6 dagen RA-inductie de differentiatie van mESC’s in NPC’s effectief bevorderen (fase I-protocol 3). Voor de fase II-differentiatie induceert N2B27 medium II (Fase II-protocol 3) het meest effectief de differentiatie van NPC’s in neuronen. Om succes te garanderen, moet meer aandacht …

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650