インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

Summary

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。

Abstract

マウス胚性幹細胞(mESC)の神経分化は、神経新生に関与する重要なメカニズムを解明し、再生医療に役立つ可能性のあるツールです。ここでは、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて、 インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を確立しました。ここで定義された条件の下で、2日間の胚体形成+6日間のレチノイン酸誘導プロトコルは、ネスチン陽性であるよく積み重ねられ、神経突起のようなA2loxおよび129誘導体の形成によって見られるように、mESCから神経前駆細胞(NPC)への迅速かつ効率的な分化を可能にする。胚体の健全な状態とレチノイン酸(RA)が適用される時点は、RA濃度と同様に、その過程で重要である。NPCからニューロンへのその後の分化において、N2B27培地II(神経基底培地によって補完される)は、神経細胞の長期的な維持および成熟をよりよく支えることができる。提示された方法は、高効率、低コスト、操作が容易であり、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。

Introduction

胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、神経前駆細胞(NPC)に分化し、その後、特定の条件下でニューロンに分化することができる^1。ESCベースの神経新生は、神経新生を模倣するための最良のプラットフォームを提供し、したがって、発生生物学研究のための有用なツールとして機能し、潜在的に再生医療^2、3を支援する。過去数十年の間に、トランスジェニック法⁴のような胚性神経新生を誘導するための多くの戦略が報告されている、小分子⁵を用いて、3Dマトリックス微小環境⁶を用いて、および共培養技術⁷を用いた。しかし、これらのプロトコルのほとんどは、条件が制限されているか、操作が困難であるため、ほとんどの研究室での使用には適していません。

mESCからの効率的な神経分化を達成するために、操作が容易で低コストの方法を見つけるために、ここで組み合わせスクリーニング戦略を使用しました。図1に記載されているように、胚性神経新生の全過程を2相に分けた。フェーズIはmESCからNPCへの分化プロセスを指し、第II相はNPCからニューロンへのその後の分化に関連する。容易な操作、低コスト、容易に利用できる材料および高い分化効率の原則に基づいて、フェーズIの7つのプロトコルおよびフェーズIIの3つのプロトコルは、伝統的な付着単層培養システムまたは胚体形成システム^8、9に基づいて選択された。両相におけるプロトコルの分化効率を、細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを用いて評価した。各フェーズの最も効率的なプロトコルを組み合わせることで、mESCからの神経分化のための最適化された方法を確立しました。

Protocol

1. マウス胚性幹細胞培養 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養皿またはプレートを準備します。 滅菌した0.1%のゼラチン(水中0.1%w/v)を60mm細胞培養皿に2mL加えます。細胞培養皿のコーティングを確実にするために、穏やかにロックします。 37°Cで5%CO2インキュベーターに皿を入れ、1時間コーティングを行います。 細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を…

Representative Results

2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導は、MESCのNPCへの分化(フェーズI)を導くのに最適です。MESCsのNPCへの分化を最も促進する最適なプロトコル(フェーズI)を決定するために、A2loxと129 mESCsの両方で7つのプロトコルをテストし、各群の分化状況を光顕微鏡で監視した。 図3Aに示すように、ほとんどのA2loxおよび129誘導体は「2日間の胚体形成+6日間のRA誘導」処置(フェ…

Discussion

本研究では、低コストで容易に得られる物質を用いて、mESCからの神経細胞分化の簡便かつ効果的な方法を確立した。この方法では、2日間の胚体形成後に6日間のRA誘導が行われ、MESCsのNPCへの分化を効果的に促進することができる(フェーズI-プロトコル3)。第II相分化のために、N2B27培地II(フェーズII-プロトコル3)は、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導する。成功を確実にするため?…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650