Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Summary

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Abstract

A diferenciação neural das células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) é uma ferramenta potencial para elucidar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese e potencialmente ajudar na medicina regenerativa. Aqui, estabelecemos um método eficiente e de baixo custo para diferenciação neuronal dos mESCs invitro, utilizando a estratégia de triagem combinatória. Sob as condições aqui definidas, a formação do corpo embrionário de 2 dias + protocolo de indução de ácido retinóico de 6 dias permite diferenciação rápida e eficiente dos mESCs em células precursoras neurais (NPCs), como visto pela formação de A2lox bem empilhados e neuritas semelhantes a 129 derivativos que são nestin positivos. O estado saudável dos corpos embrionários e o ponto de tempo em que o ácido retinóico (RA) é aplicado, assim como as concentrações de RA, são críticos no processo. Na diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios, o N2B27 médio II (suplementado pelo meio neurobásal) poderia suportar melhor a manutenção e maturação a longo prazo das células neuronais. O método apresentado é altamente eficiente, de baixo custo e de fácil operação, podendo ser uma poderosa ferramenta para pesquisa em neurobiologia e biologia do desenvolvimento.

Introduction

As células-tronco embrionárias (ESCs) são pluripotentes e podem se diferenciar em células precursoras neurais (NPCs) e, posteriormente, em neurônios sob certas condições¹. A neurogênese baseada em ESC fornece a melhor plataforma para imitar neurogênese, servindo assim como uma ferramenta útil para estudos de biologia do desenvolvimento e potencialmente auxiliar na medicina regenerativa^2,3. Nas últimas décadas, muitas estratégias foram relatadas para induzir neurogênese embrionária, como o método transgênico⁴, utilizando pequenas moléculas⁵, utilizando um microambiente de matriz^{3D 6}, e a técnica de cocultura⁷. No entanto, a maioria desses protocolos são limitados ou difíceis de operar, portanto, não são adequados para uso na maioria dos laboratórios.

Para encontrar um método fácil de operar e de baixo custo para obter uma diferenciação neural eficiente dos mESCs, uma estratégia de triagem combinatória foi usada aqui. Conforme descrito na Figura 1,todo o processo de neurogênese embrionária foi dividido em 2 fases. A fase I refere-se ao processo de diferenciação dos mESCs em NPCs, e a fase II refere-se à diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios. Com base nos princípios de fácil operação, baixo custo, materiais facilmente disponíveis e alta eficiência de diferenciação, foram escolhidos sete protocolos na Fase I e três na Fase II com base no sistema tradicional de cultura monocamadas aderente ou no sistema de formação corporal embrionário^8,9. A diferenciação de eficiência dos protocolos em ambas as fases foi avaliada por meio da observação da morfologia celular e do ensaio de imunofluorescência. Através da combinação do protocolo mais eficiente de cada fase, estabelecemos o método otimizado para diferenciação neural dos mESCs.

Protocol

1. Cultura de células-tronco embrionárias do rato Prepare 0,1% de pratos ou pratos de cultura celular revestido de gelatina. Adicione 2 mL de gelatina esterilizada de 0,1% (0,1% w/v em água) a pratos de cultura celular de 60 mm. Arrase suavemente para garantir até mesmo o revestimento dos pratos da cultura celular. Coloque os pratos em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C e deixe o revestimento por 1h. Remova a solução de gelatina de 0,1% antes de semear as célula…

Representative Results

Formação corporal embrionária de 2 dias + a indução de RA de 6 dias funciona melhor na direção da diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I). Para determinar o protocolo ideal que melhor promove a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I), 7 protocolos foram testados tanto em A2lox quanto em 129 mESCs(Tabela 1) e o status de diferenciação de cada grupo foi monitorado por microscópio leve. Como mostrado na Figura 3A, a maioria dos derivados A2lox e 129 em formação …

Discussion

No presente estudo, estabelecemos um método simples e eficaz para diferenciação neuronal dos mESCs, com baixo custo e materiais de fácil obtenção. Neste método, 2 dias de formação corporal embrionária seguida de 6 dias de indução de RA podem efetivamente promover a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I-protocolo 3). Para a diferenciação da fase II, o N2B27 médio II (Fase II-protocolo 3) induz mais efetivamente a diferenciação dos NPCs em neurônios. Para garantir o sucesso, mais atenção deve ser dad…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650