시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

Summary

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

Abstract

마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

Introduction

배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건^1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학^2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자^5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경^6,공동배양기술^7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.

mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템^8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.

Protocol

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오. 멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다. 세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다…

Representative Results

2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 “2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도” 치?…

Discussion

본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650