Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.
Abstract
Die Genexpressionsanalyse des menschlichen Nierengewebes ist ein wichtiges Werkzeug, um Homöostase und Krankheitspathophysiologie zu verstehen. Es ist notwendig, die Auflösung und Tiefe dieser Technologie zu erhöhen und sie auf die Ebene der Zellen im Gewebe auszudehnen. Obwohl die Verwendung von einzelnuklearen und einzelzelligen RNA-Sequenzierungen weit verbreitet ist, behalten die Expressionssignaturen von Zellen, die aus der Gewebedissoziation gewonnen werden, keinen räumlichen Kontext bei. Lasermikrodissektion (LMD) auf Basis spezifischer fluoreszierender Marker würde die Isolierung spezifischer Strukturen und Zellgruppen von Interesse mit bekannter Lokalisierung ermöglichen und so den Erwerb von räumlich verankerten transkriptomischen Signaturen im Nierengewebe ermöglichen. Wir haben eine LMD-Methodik optimiert, die von einem schnellen fluoreszenzbasierten Fleck geleitet wird, um fünf verschiedene Kompartimente innerhalb der menschlichen Niere zu isolieren und anschließende RNA-Sequenzierungen von wertvollen menschlichen Nierengewebeproben durchzuführen. Wir stellen auch Qualitätskontrollparameter vor, um die Angemessenheit der gesammelten Proben beurteilen zu können. Der in diesem Manuskript beschriebene Workflow zeigt die Durchführbarkeit dieses Ansatzes, subsegmentale transkriptomische Signaturen mit hoher Sicherheit zu isolieren. Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann auch auf andere Gewebetypen mit Substitution relevanter Antikörpermarker angewendet werden.
Introduction
Technologische Fortschritte bei der Untersuchung von Gewebeproben haben das Verständnis des Gesundheitszustands und der Krankheit in verschiedenen Organen verbessert. Solche Fortschritte haben unterstrichen, dass Pathologie in begrenzten Regionen oder in bestimmten Zelltypen beginnen kann, aber wichtige Auswirkungen auf das gesamte Organ hat. Daher ist es im gegenwärtigen Alter der personalisierten Medizin wichtig, die Biologie sowohl auf Zell- als auch auf regionaler Ebene zu verstehen und nicht nur weltweit1. Dies gilt insbesondere für die Niere, die aus verschiedenen spezialisierten Zellen und Strukturen besteht, die differenziell pathologischen Stress initiieren und/oder darauf reagieren. Die Pathogenese verschiedener Arten menschlicher Nierenerkrankungen ist noch immer nicht gut verstanden. Die Generierung einer Methodik zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression in bestimmten röhrenförmigen Segmenten, Strukturen oder Bereichen des Interstitiums in der menschlichen Niere wird die Fähigkeit verbessern, regionale spezifische Veränderungen aufzudecken, die über die Pathogenese von Krankheiten informieren könnten.
Menschliche Nierenbiopsie-Proben sind eine begrenzte und wertvolle Ressource. Daher sollten Technologien, die Transkriptomik im Nierengewebe verhören, optimiert werden, um Gewebe zu sparen. Zu den verfügbaren Methoden zur Untersuchung der Transkriptomik auf Zell- und Regionaler Ebene gehören die einzellige RNA-Sequenzierung (scRNaseq), die einzelne kernatoische RNaseq (snRNaseq), die räumliche In-situ-Hybridisierung und die Lasermikrodissektion (LMD). Letzteres eignet sich gut für die präzise Isolierung von Regionen oder Strukturen von Interesse innerhalb von Gewebeabschnitten, für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung und -Analyse2,3,4,5. LMD kann angenommen werden, um sich auf die Identifizierung bestimmter Zelltypen oder Strukturen basierend auf validierten Markern zu verlassen, die fluoreszenzbasierte Bildgebung während der Zerlegung verwenden.
Zu den einzigartigen Merkmalen der lasermikrodissektionengestützten regionalen Transkriptomik gehören: 1) die Erhaltung des räumlichen Kontextes von Zellen und Strukturen, die Einzelzelltechnologien ergänzt, bei denen Zellen durch Expression und nicht durch Histologie identifiziert werden; 2) die Technologie informiert und wird durch andere Bildgebungstechnologien informiert, weil ein Antikörpermarker Ausdruckssignaturen definiert; 3) die Fähigkeit, Strukturen zu identifizieren, auch wenn sich Marker in Derkrankheit ändern; 4) Nachweis von niedrig exprimierenden Transkripten in etwa 20.000 Genen; und 5) bemerkenswerte Gewebewirtschaft. Die Technologie ist skalierbar für eine Nierenbiopsie mit einer Dicke von weniger als 100 m eines Kerns, der für eine ausreichende RNA-Erfassung notwendig ist, und ermöglicht die Verwendung von archiviertem gefrorenem Gewebe, das in großen Repositories oder akademischen Zentren allgemein verfügbar ist6.
In der anschließenden Arbeit beschreiben wir die regionale und Massen-Transkriptomik-Technologie im Detail, optimiert mit einem neuartigen schnellen Fluoreszenz-Färbeprotokoll für die Verwendung mit menschlichem Nierengewebe. Dieser Ansatz verbessert die klassischen LMD-Explorationen, da er separate Ausdrucksdaten für die Interstitium- und Nephron-Untersegmente im Gegensatz zu aggregierter tubulointerstitialer Expression bereitstellt. Dazu gehören die Qualitätssicherungs- und Kontrollmaßnahmen, die zur Gewährleistung von Strenge und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Interessensgebieten, was zu einer zufriedenstellenden Erfassung von RNA aus diesen isolierten Bereichen führt, um eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD-basierte Transkriptomik ist eine nützliche Technologie, die die Genexpression an bestimmten Bereichen im Gewebe verankert. Die Basis dieser Technologie und ihre mögliche Anwendung in der Niere wurde zuvor beschrieben8. Die Optimierung, Modernisierung und Rationalisierung der fluoreszenzbasierten Dissektion, die speziell auf eine hochpräzise Sesektion für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung ausgerichtet ist, ist jedoch weniger allgegenwärtig. Da diese Methode räumlich im Gewebe begründ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Allgemeines: Die Autoren danken den Forschern des Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) für ihre gnädige Unterstützung und Beratung.
Finanzierung: Unterstützung für diese Arbeit wurde vom NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) bereitgestellt; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), unter der Auszeichnungsnummer U2CDK114886 unterstützt.
Daten- und Materialverfügbarkeit: Die Daten werden im Gene Expression Omnibus (GEO – ausstehend) archiviert.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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