Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano
Summary
Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l’arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l’interstizio. L’RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell’RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all’interno di ogni sottoseme.
Abstract
L’analisi dell’espressione genica del tessuto renale umano è uno strumento importante per comprendere l’omeostasi e la fisiopatologia delle malattie. È necessario aumentare la risoluzione e la profondità di questa tecnologia ed estenderla al livello di cellule all’interno del tessuto. Sebbene l’uso del sequenziamento dell’RNA a singola e singola cellula si sia diffuso, le firme di espressione delle cellule ottenute dalla dissociazione tissutale non mantengono il contesto spaziale. La microdisezione laser (LMD) basata su specifici marcatori fluorescenti consentirebbe l’isolamento di strutture specifiche e gruppi cellulari di interesse con la localizzazione nota, consentendo così l’acquisizione di firme trascritomiche ancorate spazialmente nel tessuto renale. Abbiamo ottimizzato una metodologia LMD, guidata da una rapida macchia a base di fluorescenza, per isolare cinque compartimenti distinti all’interno del rene umano e condurre il successivo sequenziamento dell’RNA da preziosi campioni di tessuto renale umano. Presentiamo anche parametri di controllo qualità per consentire la valutazione dell’adeguatezza dei campioni raccolti. Il flusso di lavoro delineato in questo manoscritto mostra la fattibilità di questo approccio per isolare le firme trascrittimiche sottoserticate con grande fiducia. L’approccio metodologico qui presentato può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con sostituzione di marcatori anticorpali pertinenti.
Introduction
I progressi tecnologici nello studio dei campioni di tessuto hanno migliorato la comprensione dello stato di salute e delle malattie in vari organi. Tali progressi hanno sottolineato che la patologia può iniziare in regioni limitate o in specifici tipi di cellule, ma hanno importanti implicazioni sull’intero organo. Pertanto, nell’attuale era della medicina personalizzata, è importante comprendere la biologia sia a livello cellulare che regionale e non solo a livello globale1. Ciò è particolarmente vero nel rene, che è composto da varie cellule e strutture specializzate che avviano e/o rispondono in modo differenziato allo stress patologico. La patogenesi di vari tipi di malattia renale umana non è ancora ben compresa. La generazione di una metodologia per studiare i cambiamenti nell’espressione genica in specifici segmenti tubolari, strutture o aree dell’interstizio nel rene umano migliorerà la capacità di scoprire cambiamenti specifici della regione che potrebbero informare sulla patogenesi della malattia.
Gli esemplari di biopsia renale umana sono una risorsa limitata e preziosa. Pertanto, le tecnologie che interrogano la trascritomica nel tessuto renale dovrebbero essere ottimizzate per economizzare il tessuto. I metodi disponibili per studiare la trascrittomica a livello cellulare e regionale includono il sequenziamento dell’RNA a singola cella (scRNaseq), il RNaseq nucleare singolo (snRNaseq), l’ibridazione spaziale in situ e la microdisezione laser (LMD). Quest’ultimo è adatto per un preciso isolamento di regioni o strutture di interesse all’interno di sezioni tissutali, per il sequenziamento e l’analisi dell’RNA a valle2,3,4,5. LMD può essere adottato per fare affidamento sull’identificazione di specifici tipi di cellule o strutture basate su marcatori convalidati utilizzando l’imaging a base di fluorescenza durante la dissezione.
Le caratteristiche uniche della trascrittomica regionale assistita da microdisezione laser includono: 1) la conservazione del contesto spaziale di cellule e strutture, che integra le tecnologie a singola cellula in cui le cellule sono identificate per espressione piuttosto che istologicamente; 2) la tecnologia informa ed è informata da altre tecnologie di imaging perché un marcatore anticorpale definisce le firme di espressione; 3) la capacità di identificare le strutture anche quando i marcatori cambiano nella malattia; 4) rilevazione di trascrizioni a bassa espressa in circa 20.000 geni; e 5) notevole economia tissutale. La tecnologia è scalabile a una biopsia renale con uno spessore inferiore a 100 μm di un nucleo necessario per una sufficiente acquisizione di RNA e consente l’uso di tessuti congelati archiviati, che sono comunemente disponibili in grandi depositi o centri accademici6.
Nel lavoro che ne è seguito, descriviamo in dettaglio la tecnologia trascrittamica regionale e di massa, ottimizzata con un nuovo protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per l’uso con tessuto renale umano. Questo approccio migliora le esplorazioni LMD classiche perché fornisce dati di espressione separati per i sottoserti di interstizio e nefrone rispetto all’espressione tubulointerstiziale aggregata. Sono incluse le misure di garanzia della qualità e di controllo attuate per garantire rigore e riproducibilità. Il protocollo consente la visualizzazione di cellule e regioni di interesse, con conseguente acquisizione soddisfacente di RNA da queste aree isolate per consentire il sequenziamento dell’RNA a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La trascritomica basata su LMD è una tecnologia utile che ancora l’espressione genica a aree specifiche all’interno del tessuto. La base di questa tecnologia e la sua potenziale applicazione nel rene è stata descritta in precedenza8. Tuttavia, l’ottimizzazione, la modernizzazione e la razionalizzazione della dissezione basata sulla fluorescenza specificamente finalizzata alla dissezione ad alta precisione per il sequenziamento dell’RNA a valle è meno onnipresente. Poiché questa metodologia è …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Generale: Gli autori ringraziano gli investigatori del Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) per il loro gentile supporto e consiglio.
Finanziamento: Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), con il numero di premio U2CDK114886.
Disponibilità di dati e materiali: I dati vengono archiviati nel Gene Expression Omnibus (GEO # in sospeso)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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