Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano
Summary
Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.
Abstract
El análisis de la expresión génica del tejido renal humano es una herramienta importante para entender la homeostasis y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesita aumentar la resolución y profundidad de esta tecnología y extenderla al nivel de las células dentro del tejido. Aunque el uso de secuenciación única de ARN nuclear y unicelular se ha generalizado, las firmas de expresión de las células obtenidas de la disociación tisular no mantienen el contexto espacial. La microdisección láser (LMD) basada en marcadores fluorescentes específicos permitiría el aislamiento de estructuras específicas y grupos celulares de interés con localización conocida, permitiendo así la adquisición de firmas transcriptómicas ancladas espacialmente en el tejido renal. Hemos optimizado una metodología LMD, guiada por una mancha rápida a base de fluorescencia, para aislar cinco compartimentos distintos dentro del riñón humano y llevar a cabo la posterior secuenciación de ARN de valiosas muestras de tejido renal humano. También presentamos parámetros de control de calidad para permitir la evaluación de la adecuación de los especímenes recogidos. El flujo de trabajo descrito en este manuscrito muestra la viabilidad de este enfoque para aislar firmas transcriptómicas sub-segmentales con alta confianza. El enfoque metodológico que se presenta aquí también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con la sustitución de marcadores de anticuerpos relevantes.
Introduction
Los avances tecnológicos en el estudio de muestras de tejidos han mejorado la comprensión del estado de salud y enfermedades en varios órganos. Estos avances han puesto de relieve que la patología puede comenzar en regiones limitadas o en tipos celulares específicos, pero tienen implicaciones importantes en todo el órgano. Por lo tanto, en la era actual de la medicina personalizada, es importante entender la biología tanto a nivel celular como regional y no sólo a nivel mundial1. Esto es particularmente cierto en el riñón, que se compone de varias células especializadas y estructuras que inician y/o responden diferencialmente al estrés patológico. La patogénesis de varios tipos de enfermedad renal humana todavía no se entiende bien. Generar una metodología para estudiar los cambios en la expresión génica en segmentos tubulares específicos, estructuras o áreas del interstitium en el riñón humano mejorará la capacidad de descubrir cambios específicos de la región que podrían informar sobre la patogénesis de la enfermedad.
Los especímenes de biopsia renal humana son un recurso limitado y precioso. Por lo tanto, las tecnologías que interrogan la transcriptómica en el tejido renal deben optimizarse para economizar el tejido. Los métodos disponibles para estudiar la transcriptómica a nivel celular y regional incluyen secuenciación de ARN de una sola célula (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridación espacial in situ y microdissección láser (LMD). Este último es adecuado para el aislamiento preciso de regiones o estructuras de interés dentro de las secciones de tejido, para secuenciación y análisis de ARN aguas abajo2,3,4,5. La LMD se puede adoptar para basarse en la identificación de tipos o estructuras celulares específicas basadas en marcadores validados utilizando imágenes basadas en fluorescencia durante la disección.
Las características únicas de la transcriptómica regional asistida por microdisección láser incluyen: 1) la preservación del contexto espacial de las células y estructuras, que complementa las tecnologías unicelulares donde las células se identifican por expresión en lugar de histológicamente; 2) la tecnología informa y es informada por otras tecnologías de imágenes porque un marcador de anticuerpos define firmas de expresión; 3) la capacidad de identificar estructuras incluso cuando los marcadores cambian en la enfermedad; 4) detección de transcripciones poco expresadas en aproximadamente 20.000 genes; y 5) notable economía de tejidos. La tecnología es escalable a una biopsia renal con menos de 100 μm de espesor de un núcleo necesario para la adquisición suficiente de ARN y permite el uso de tejido congelado archivado, que comúnmente están disponibles en grandes repositorios o centros académicos6.
En el trabajo subsiguiente, describimos la tecnología de transcriptómica regional y a granel en detalle, optimizada con un nuevo protocolo de tinción rápida de fluorescencia para su uso con tejido renal humano. Este enfoque mejora las exploraciones lmd clásicas porque proporciona datos de expresión independientes para los subsegmentos de interstitium y nefrón en lugar de la expresión tubulointersticial agregada. Se incluyen las medidas de control y garantía de calidad implementadas para garantizar el rigor y la reproducibilidad. El protocolo permite la visualización de células y regiones de interés, lo que resulta en la adquisición satisfactoria de ARN de estas áreas aisladas para permitir la secuenciación de ARN aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transcriptómica basada en LMD es una tecnología útil que ancla la expresión génica a áreas específicas dentro del tejido. La base de esta tecnología y su aplicación potencial en el riñón se ha descrito anteriormente8. Sin embargo, la optimización, modernización y racionalización de la disección basada en la fluorescencia específicamente dirigida a la disección de alta precisión para la secuenciación de ARN aguas abajo es menos omnipresente. Debido a que esta metodología est?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
General: Los autores quieren agradecer a los investigadores del Proyecto de Medicina de Precisión Renal (www.kpmp.org) por su amable apoyo y asesoramiento.
Financiación: El soporte para este trabajo fue proporcionado por el NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Proyecto de Medicina de Precisión Renal (KPMP) del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), (www.kpmp.org), bajo el número de premio U2CDK114886.
Disponibilidad de datos y materiales: Los datos se archivan en el Ómnibus de expresión génica (GEO # pendiente)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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