Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.
Анализ экспрессии генов тканей почек человека является важным инструментом для понимания гомеостаза и патофизиологии заболеваний. Необходимо увеличить разрешение и глубину этой технологии и расширить ее до уровня клеток в тканях. Хотя использование одноядерной и одноклеточной РНК-секвенирования получило широкое распространение, экспрессионные сигнатные знаки клеток, полученных в результате диссоциации тканей, не поддерживают пространственного контекста. Лазерная микроперепись (ЛМД) на основе специфических флуоресцентных маркеров позволит изоляции конкретных структур и клеточных групп, представляющих интерес с известной локализации, тем самым позволяя приобретение пространственно якорных транскриптомных подписей в ткани почек. Мы оптимизировали методологию LMD, руководствуясь быстрым пятном на основе флуоресценции, чтобы изолировать пять различных отсеков в почках человека и провести последующее секвенирование РНК из ценных образцов тканей почек человека. Мы также представляем параметры контроля качества, позволяющие оценить адекватность собранных образцов. Рабочий процесс, изложенный в этой рукописи, показывает осуществимость такого подхода к изоляции подкломентальных транскриптомных подписей с высокой достоверностью. Представленный здесь методологический подход может быть применен и к другим типам тканей с заменой соответствующих маркеров антител.
Технологический прогресс в изучении образцов тканей улучшил понимание состояния здоровья и заболеваний в различных органах. Такие достижения подчеркивают, что патология может начаться в ограниченных регионах или в конкретных типах клеток, но имеют важные последствия для всего органа. Поэтому в нынешнюю эпоху персонализированной медицины важно понимать биологию как на клеточном, так и на региональном уровне, а не только глобально1. Это особенно верно в почках, которая состоит из различных специализированных клеток и структур, которые дифференцированно инициировать и / или реагировать на патологический стресс. Патогенез различных типов заболеваний почек человека до сих пор не очень хорошо изучен. Создание методологии для изучения изменений экспрессии генов в конкретных трубчатых сегментах, структурах или областях интерстиция в почках человека повысит способность выявить конкретные изменения региона, которые могли бы информировать о патогенеза болезни.
Образцы биопсии почек человека являются ограниченным и ценным ресурсом. Поэтому технологии, допрашивающие транскриптомику в тканях почек, должны быть оптимизированы для экономии тканей. Доступные методы изучения транскриптомики на клеточном и региональном уровне включают одноклеточное секвенирование РНК (scRNaseq), одноядерную RNaseq (snRNaseq), пространственную гибридизацию на месте и лазерное микродиссекцию (LMD). Последний хорошо подходит для точной изоляции регионов или структур, представляющих интерес в секциях тканей, для секвенирования ианализа РНК вниз по течению 2,3,4,5. LMD может быть принят, чтобы полагаться на идентификацию конкретных типов клеток или структур на основе проверенных маркеров с использованием флуоресценции на основе изображений во время вскрытия.
Уникальные особенности лазерной микроперепись помощь региональной транскриптомики включают в себя: 1) сохранение пространственного контекста клеток и структур, который дополняет одноклеточных технологий, где клетки идентифицируются по выражению, а не гисто логики; 2) технология информирует и информируется другими технологиями визуализации, потому что маркер антител определяет экспрессионные подписи; 3) способность определять структуры даже при изменении маркеров заболевания; 4) обнаружение низко выраженных транскриптов примерно в 20 000 генов; и 5) замечательная экономия тканей. Технология масштабируется для биопсии почек с толщиной менее 100 мкм ядра, необходимого для достаточного приобретения РНК и позволяет использовать архивные замороженные ткани, которые обычно доступны в крупных хранилищах или академическихцентрах 6.
В последующей работе мы подробно описываем региональную и объемную технологию транскриптомики, оптимизированную новым протоколом быстрого окрашивания флуоресценции для использования в почечной ткани человека. Этот подход улучшает классические исследования LMD, поскольку он обеспечивает отдельные данные выражения для интерстиций и нефронных подсектов, в отличие от агрегированного тубулоинтерстициального выражения. Включены меры по обеспечению качества и контролю, принятые для обеспечения строгости и воспроизводимости. Протокол позволяет визуализировать ячейки и области, представляющие интерес, что приводит к удовлетворительному приобретению РНК из этих изолированных районов, чтобы позволить секвенированию РНК ниже по течению.
Транскриптомика на основе LMD является полезной технологией, которая закрепляет экспрессию генов в определенных областях ткани. Основа этой технологии и ее потенциальное применение в почках было описано ранее8. Однако оптимизация, модернизация и оптимизация вскрытия на ос…
The authors have nothing to disclose.
Общие: Авторы хотели бы поблагодарить исследователей проекта точной медицины почек (www.kpmp.org) за их любезное поддержку и советы.
Финансирование: Поддержку этой работе оказал NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и заболеваний почек (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP) (www.kpmp.org), под номером U2CDK114886.
Доступность данных и материалов: Данные архивируются в Omnibus экспрессии генов (GEO )
Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
BSA | VWR | 0332-100G | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
Microscope camera | Leica | DFC700T | |
PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |