Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies
Summary
Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-putplaat voor afschuifspanningstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel.
Abstract
Schuifspanning opgelegd aan de arteriële wand door de bloedstroom beïnvloedt endotheelcelmorfologie en functie. Lage magnitude, oscillatoire en multidirectionele afschuifspanningen zijn allemaal gepostuleerd om een pro-atherosclerotisch fenotype in endotheelcellen te stimuleren, terwijl hoge magnitude en unidirectionele of uniaxiale afschuiving worden verondersteld endotheliale homeostase te bevorderen. Deze hypothesen vereisen verder onderzoek, maar traditionele in vitro technieken hebben beperkingen en zijn bijzonder slecht in het opleggen van multidirectionele schuifspanningen aan cellen.
Een methode die steeds meer wordt gebruikt, is het gekweekt van endotheelcellen in standaard multi-well platen op het platform van een orbitale shaker; in deze eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer en chronische methode produceert het wervelende medium verschillende patronen en magnitudes van afschuiving, waaronder multidirectionele afschuiving, in verschillende delen van de put. Het heeft echter een aanzienlijke beperking: cellen in één regio, blootgesteld aan één type stroom, kunnen mediatoren afgeven in het medium die cellen in andere delen van de put beïnvloeden, blootgesteld aan verschillende stromen, waardoor de schijnbare relatie tussen stroom en fenotype wordt verstoord.
Hier presenteren we een eenvoudige en betaalbare aanpassing van de methode waarmee cellen alleen kunnen worden blootgesteld aan specifieke afschuifspanningskenmerken. Celzaden is beperkt tot een bepaald gebied van de put door het gebied van belang te coaten met fibronectine, gevolgd door passivering met passiverende oplossing. Vervolgens kunnen de platen op de shaker worden gewerveld, wat resulteert in blootstelling van cellen aan goed gedefinieerde afschuifprofielen zoals multidirectionele afschuiving met een lage magnitude of uniaxiale afschuiving met een hoge magnitude, afhankelijk van hun locatie. Net als voorheen maakt het gebruik van standaard celkweekplasticware een eenvoudige verdere analyse van de cellen mogelijk. De wijziging heeft al de demonstratie mogelijk gemaakt van oplosbare mediatoren, die vrijkomen uit endotheel onder gedefinieerde kenmerken van schuifspanning, die cellen elders in de put beïnvloeden.
Introduction
Reacties van vasculaire cellen op hun mechanische omgeving zijn belangrijk in de normale functie van bloedvaten en bij de ontwikkeling van ziekte1. De mechanobiologie van de endotheelcellen (EC’s) die het binnenoppervlak van alle bloedvaten belijnen, is een bijzondere focus van mechanobiologisch onderzoek geweest, omdat EC’s direct de schuifspanning ervaren die wordt gegenereerd door de bloedstroom eroverheen. Verschillende fenotypische veranderingen zoals ontstekingsreacties, veranderde stijfheid en morfologie, de afgifte van vasoactieve stoffen en de lokalisatie en expressie van junctionele eiwitten zijn afhankelijk van eg-blootstelling aan schuifspanning2,3,4. Afschuifafhankelijke endotheeleigenschappen kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de fragmentarische ontwikkeling van ziekten zoals atherosclerose5,6,7.
Het is nuttig om het effect van afschuiving op EC’s in cultuur te bestuderen, waar spanningen kunnen worden gecontroleerd en EC’s kunnen worden geïsoleerd van andere celtypen. Veelgebruikte in vitro apparaten voor het toepassen van schuifspanning op EC’s zijn de parallelplaatstroomkamer en de kegel-en-plaatviscometer, maar alleen eenassige steady, oscillatory en pulsatile flow kunnen worden toegepast8,9. Hoewel gewijzigde stromingskamers met taps toelopende of vertakkende geometrieën en microfluïdische chips die een stenotische geometrie nabootsen zijn ontwikkeld , vormen hun lage doorvoer en de relatief korte cultuurduur die mogelijk is een uitdaging10, 11.
De orbitale shaker (of wervelende put) methode voor de studie van endotheelmechanotransductie, waarbij cellen worden gekweekt in standaard celkweekplasticware geplaatst op het platform van een orbitale shaker, krijgt steeds meer aandacht omdat het in staat is om chronisch complexe, ruimtelijk variërende schuifspanningspatronen op EC’s met een hoge doorvoer op te leggen (zie review door Warboys et al.12). Computational Fluid Dynamics (CFD) simulaties zijn gebruikt om de ruimtelijke en temporele variatie van schuifspanning in een wervelende put te karakteriseren. De wervelende beweging van cultuurmedium veroorzaakt door de orbitale beweging van het schudplatform waarop de plaat is geplaatst, leidt tot Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, of putatively pro-atherogene flow) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, of putatively atheroprotective flow) aan de rand van de putten van een 6-wells plaat. De tijdgemiddelde wandschaarspanning (TAWSS) is bijvoorbeeld ongeveer 0,3 Pa in het midden en 0,7 Pa aan de rand van een 6-putplaat die bij 150 tpm met een omloopradius van 5 mm13wordt gewerveld. De methode vereist alleen in de handel verkrijgbaar plastic en de orbitale shaker zelf.
Er is echter een nadeel aan de methode (en aan andere methoden om stromen in vitro op te leggen): EC’s geven op een afschuifafhankelijke manier oplosbare mediatoren en microdeeltjes vrij14,15,16 en dit secretoom kan ECs beïnvloeden in andere gebieden van de put dan die waar ze zijn vrijgegeven, als gevolg van het mengen in het wervelende medium. Dit kan de werkelijke effecten van afschuifspanning op het EG-fenotype maskeren. Ghim et al. hebben bijvoorbeeld gespeculeerd dat dit verantwoordelijk is voor de ogenschijnlijk identieke invloed van verschillende afschuifprofielen op het transcellulaire transport van grote deeltjes17.
Hier beschrijven we een methode voor het bevorderen van de hechting van menselijke navelstrengaadotheelcellen (HUVEC) in specifieke gebieden van een 6-putplaat met behulp van fibronectinecoating tijdens het gebruik van Pluronic F-127 om het oppervlak te passiveren en groei elders te voorkomen. De methode lost de hierboven beschreven beperking op, omdat EC’s door celgroei te segmenteren slechts één soort afschuifprofiel ervaren en niet worden beïnvloed door secretomen van EC’s die elders in de put aan andere profielen worden blootgesteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
De swirling-well methode is in staat om complexe flowprofielen te genereren in een enkele put – Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) aan de rand van de put. Shear stress-gemedieerde afscheidingen van oplosbare mediatoren worden echter gemengd in het wervelende medium en beïnvloeden cellen in de hele put, waardoor mogelijk het ware effect van een bepaald afschuifspanningsprofiel op de cellen wordt gemaskeerd.
De hier gedemonstreerde co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dankbaar een projectbeurs van de British Heart Foundation (aan PDW), een National Medical Research Council Singapore TAAP en DYNAMO Grant (aan XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), een A*STAR Graduate Scholarship (aan KTP) en een British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (to MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
