Segmentazione della crescita delle cellule endoteliali in piastre a 6 pozzi su uno shaker orbitale per studi meccanobiologici
Summary
Questo protocollo descrive un metodo di rivestimento per limitare la crescita delle cellule endoteliali a una regione specifica di una piastra a 6 po porsi per l’applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando il modello di agitatore orbitale.
Abstract
Lo stress da taglio imposto alla parete arteriosa dal flusso sanguigno influisce sulla morfologia e sulla funzione delle cellule endoteliali. Sollecitazioni di taglio di bassa magnitudine, oscillatorie e multidirezionali sono state tutte postulate per stimolare un fenotipo pro-aterosclerotico nelle cellule endoteliali, mentre si pensa che l’alta magnitudine e il taglio unidirezionale o uniassiale promuovano l’omeostasi endoteliale. Queste ipotesi richiedono ulteriori indagini, ma le tecniche tradizionali in vitro hanno dei limiti e sono particolarmente povere nell’imporre sollecitazioni di taglio multidirezionali sulle cellule.
Un metodo che sta guadagnando sempre più uso è quello di coltura delle cellule endoteliali nelle piastre standard multi-pozzo sulla piattaforma di uno shaker orbitale; in questo metodo semplice, a basso costo, ad alta produttività e cronico, il mezzo vorticoso produce diversi modelli e magnitudini di taglio, incluso il taglio multidirezionale, in diverse parti del pozzo. Tuttavia, ha una limitazione significativa: le cellule in una regione, esposte a un tipo di flusso, possono rilasciare mediatori nel mezzo che influenzano le cellule in altre parti del pozzo, esposte a flussi diversi, distorcendo così la relazione apparente tra flusso e fenotipo.
Qui presentiamo una modifica facile e conveniente del metodo che consente alle cellule di essere esposte solo a specifiche caratteristiche di sollecitazione di taglio. La semina cellulare è limitata a una regione definita del pozzo rivestendo la regione di interesse con fibronectina, seguita da passivazione utilizzando soluzione passivante. Successivamente, le piastre possono essere ruotate sullo shaker, con conseguente esposizione delle cellule a profili di taglio ben definiti come taglio multidirezionale di bassa magnitudine o taglio uniassiale di alta magnitudine, a seconda della loro posizione. Come in precedenza, l’uso di plastware standard per la coltura cellulare consente un’ulteriore analisi diretta delle cellule. La modifica ha già permesso la dimostrazione di mediatori solubili, rilasciati dall’endotelio con caratteristiche di sollecitazione di taglio definite, che colpiscono le cellule situate altrove nel pozzo.
Introduction
Le risposte delle cellule vascolari al loro ambiente meccanico sono importanti nella normale funzione dei vasi sanguigni e nello sviluppo della malattia1. La meccanobiologia delle cellule endoteliali (EC) che ricorrono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni è stata un particolare obiettivo della ricerca meccanobiologica perché gli EC sperimentano direttamente lo stress da taglio generato dal flusso sanguigno su di essi. Vari cambiamenti fenotipico come risposte infiammatorie, rigidità e morfologia alterate, rilascio di sostanze vasoattive e localizzazione ed espressione delle proteine giunzionali dipendono dall’esposizione della CE allo stress dataglio 2,3,4. Le proprietà endoteliali shear-dependent possono anche tenere conto dello sviluppo irregolare di malattie come l’aterosclerosi5,6,7.
È utile studiare l’effetto del taglio sui CES in coltura, dove le sollecitazioni possono essere controllate, e gli EC possono essere isolati da altri tipi di cellule. I dispositivi in vitro comunemente utilizzati per l’applicazione della sollecitazione di taglio agli EC includono la camera di flusso a piastre parallele e il viscometer a cono e piastra, ma solo il flusso uniassiale costante, oscillatorio e pulsatile puòessere applicato 8,9. Sebbene siano state sviluppate camere di flusso modificate con geometrie affusolata o ramificata e chip microfluidici che imitano una geometria stenotica, la loro bassa produttività e la durata di coltura relativamente breve che è possibile rappresentano unasfida 10, 11.
Il metodo dello shaker orbitale (o pozzo vorticoso) per lo studio della meccanotrasduzione endoteliale, in cui le cellule sono coltivate in plasticware standard di coltura cellulare posto sulla piattaforma di uno shaker orbitale, sta guadagnando sempre più attenzione perché è in grado di imporre modelli di sollecitazione di taglio complessi e spazialmente variabili su EC ad alta produttività (vedi revisione da parte di Warboys et al.12). Simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) sono state utilizzate per caratterizzare la variazione spaziale e temporale della sollecitazione di taglio in un pozzo vorticoso. Il movimento vorticoso del mezzo di coltura causato dal moto orbitale della piattaforma dello shaker su cui è posizionata la piastra porta a un flusso multidirezionale di bassa magnitudine (LMMF, o flusso putativamente pro-aterogenico) al centro e a un flusso uniassiale di alta magnitudine (HMUF, o flusso putativamente ateroprotettivo) sul bordo dei pozzi di una piastra a 6 pozzi. Ad esempio, la sollecitazione di taglio della parete media nel tempo (TAWSS) è di circa 0,3 Pa al centro e 0,7 Pa sul bordo di una piastra a 6 po ‘vorticosa a 150 giri/min con un raggio orbitale di 5 mm13. Il metodo richiede solo stoviglie disponibili in commercio e lo shaker orbitale stesso.
Esiste tuttavia uno svantaggio nel metodo (e in altri metodi di imposizione dei flussi in vitro): gli EC rilasciano mediatori solubili e microparticelle in modo dipendente dalla cesoia14,15,16 e questo secretome può interessare i CE in regioni del pozzo diverse da quella in cui sono stati rilasciati, a causa della miscelazione nel mezzo vorticoso. Ciò può mascherare gli effetti effettivi della sollecitazione di taglio sul fenotipo CE. Ad esempio, Ghim et al.
Qui descriviamo un metodo per promuovere l’adesione della cellula endoteliale della vena ombelicale umana (HUVEC) in regioni specifiche di una piastra a 6 pozzi usando il rivestimento di fibronectina mentre si utilizza pluronico F-127 per passivare la superficie e prevenire la crescita altrove. Il metodo risolve la limitazione sopra descritta perché, segmentando la crescita cellulare, gli EC sperimentano un solo tipo di profilo di taglio e non sono influenzati da secretomi di EC esposti ad altri profili altrove nel pozzo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo del pozzo vorticoso è in grado di generare profili di flusso complessi in un unico pozzo : flusso multidirezionale di bassa magnitudo (LMMF) al centro e flusso uniassiale di alta magnitudine (HMUF) sul bordo del pozzo. Tuttavia, le secrezioni mediate dallo stress da taglio del mediatore solubile saranno mescolate nel mezzo vorticoso e influenzeranno le cellule in tutto il pozzo, mascherando potenzialmente il vero effetto di un particolare profilo di sollecitazione di taglio sulle cellule.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine una borsa di studio del progetto british heart foundation (a PDW), un National Medical Research Council Singapore TAAP e DYNAMO Grant (a XW, NMRC / OFLCG / 004/2018, NMRC / OFLCG / 001 /2017), una borsa di studio per laureati A * STAR (a KTP) e una studentessa del British Heart Foundation Center of Research Excellence (a MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
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