Segmentación Del Crecimiento De Las Células Endoteliales En Placas De 6 Pozos En Una Coctelera Orbital Para Estudios Mecanobiológicos

Summary

Este protocolo describe un método de recubrimiento para restringir el crecimiento de células endoteliales a una región específica de una placa de 6 pozos para la aplicación de esfuerzo de cizalladura utilizando el modelo de agitador orbital.

Abstract

La tensión del esquileo impuesta en la pared arterial por el flujo de sangre afecta a morfología y a la función endoteliales de la célula. Las tensiones de esquileo de baja magnitud, oscilatorias y multidireccionales se han postulado para estimular un fenotipo favorable-aterosclerótico en células endoteliales, mientras que la alta magnitud y el esquileo unidireccional o uniaxial se piensan para promover homeostasis endotelial. Estas hipótesis requieren la posterior investigación, pero las técnicas ines vitro tradicionales tienen limitaciones, y son particularmente pobres en la imposición de tensiones multidireccionales del esquilamiento en células.

Un método que está ganando uso cada vez mayor es cultivar células endoteliales en placas estándar de múltiples pozos en la plataforma de una coctelera orbital; en este método simple, de bajo costo, de alto rendimiento y crónico, el medio de remolino produce diferentes patrones y magnitudes de cizallamiento, incluida la cizalladura multidireccional, en diferentes partes del pozo. Sin embargo, tiene una limitación significativa: las células de una región, expuestas a un tipo de flujo, pueden liberar mediadores en el medio que afectan a las células en otras partes del pozo, expuestas a diferentes flujos, distorsionando así la relación aparente entre el flujo y el fenotipo.

Aquí presentamos una modificación fácil y asequible del método que permite que las células se expongan sólo a características específicas de esfuerzo de cizalladura. La siembra celular se restringe a una región definida del pozo mediante el recubrimiento de la región de interés con fibronectina, seguida de pasivación con solución pasivante. Posteriormente, las placas se pueden arremolinar en el agitador, lo que resulta en la exposición de las células a perfiles de cizallamiento bien definidos, como la cizalladura multidireccional de baja magnitud o la cizalladura uniaxial de alta magnitud, dependiendo de su ubicación. Como antes, el uso de plastificaciones estándar de cultivo celular permite un análisis adicional directo de las células. La modificación ya ha permitido la demostración de mediadores solubles, liberados del endotelio bajo características definidas de esfuerzo de cizalladura, que afectan a las células ubicadas en otras partes del pozo.

Introduction

Las respuestas de las células vasculares a su entorno mecánico son importantes en el funcionamiento normal de los vasos sanguíneos y en el desarrollo de la enfermedad¹. La mecanobiología de las células endoteliales (CE) que recubre la superficie interior de todos los vasos sanguíneos ha sido un foco particular de la investigación mecanobiológica porque los CE experimentan directamente el estrés de cizallamiento generado por el flujo sanguíneo sobre ellos. Diversos cambios fenotípicos como las respuestas inflamatorias, la alteración de la rigidez y la morfología, la liberación de sustancias vasoactivas y la localización y expresión de proteínas de unión dependen de la exposición de la CE al estrés de cizallamiento^2,3,4. Las propiedades endoteliales dependientes del cizalladura también pueden explicar el desarrollo irregular de enfermedades como la aterosclerosis^5,6,7.

Es útil estudiar el efecto de la cizalladura sobre los CE en cultivo, donde las tensiones pueden ser controladas, y los CE pueden ser aislados de otros tipos de células. Los dispositivos in vitro comúnmente utilizados para aplicar tensión de cizalladura a los CE incluyen la cámara de flujo de placa paralela y el viscosímetro de cono y placa, pero solo se puede aplicar un flujo uniaxial constante, oscilatorio y pulsátil^8,9. Aunque se han desarrollado cámaras de flujo modificadas con geometrías cónicas o ramificadas y chips microfluídicos que imitan una geometría estenótica, su bajo rendimiento y la duración relativamente corta del cultivo que es posible plantean un desafío^{10, 11.}

El método de coctelera orbital (o pozo de remolino) para el estudio de la mecanotransducción endotelial, en la que las células se cultivan en utensilios de plástico de cultivo celular estándar colocados en la plataforma de una coctelera orbital, está ganando cada vez más atención porque es capaz de imponer crónicamente patrones de tensión de cizallamiento complejos y espacialmente variables en ces con alto rendimiento (véase la revisión de Warboys et al.^12). Las simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) se han empleado para caracterizar la variación espacial y temporal de la tensión de cizalladura en un pozo girando. El movimiento de remolino del medio de cultivo causado por el movimiento orbital de la plataforma agitadora en la que se coloca la placa conduce a flujo multidireccional de baja magnitud (LMMF, o flujo supuestamente pro-aterogénico) en el centro y flujo uniaxial de alta magnitud (HMUF, o flujo supuestamente ateroprotector) en el borde de los pozos de una placa de 6 pozos. Por ejemplo, la tensión de cizalladura de pared promediada en el tiempo (TAWSS) es de aproximadamente 0,3 Pa en el centro y de 0,7 Pa en el borde de una placa de 6 pozos arremolinada a 150 rpm con un radio orbital de 5 mm^{de 13.} El método requiere sólo utensilios de plástico disponibles comercialmente y la coctelera orbital en sí.

Hay, sin embargo, un inconveniente en el método (y en otros métodos de imposición de flujos in vitro): los CE liberan mediadores solubles y micropartículas de manera dependiente del cizallamiento^14,15,16 y este secretoma puede afectar a los CE en regiones del pozo distintas de aquella en la que se liberaron, debido a la mezcla en el medio girante. Esto puede enmascarar los efectos reales de la tensión del esquilés sobre fenotipo de la EC. Por ejemplo, Ghim et al. han especulado que esto explica la influencia aparentemente idéntica de diferentes perfiles de cizalladura en el transporte transcelular de partículas grandes¹⁷.

Aquí se describe un método para promover la adhesión de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en regiones específicas de una placa de 6 pozos utilizando recubrimiento de fibronectina durante el uso de Pluronic F-127 para pasivar la superficie y prevenir el crecimiento en otros lugares. El método resuelve la limitación descrita anteriormente porque, al segmentar el crecimiento celular, los CE experimentan solo un tipo de perfil de cizallamiento, y no están influenciados por secretomas de CE expuestos a otros perfiles en otras partes del pozo.

Protocol

1. Fabricación de dispositivos y preparación de reactivos Fabricación de módulos de acero inoxidable Fabrique el módulo de acero inoxidable de un acero inoxidable de grado 316 utilizando una fresadora CNC de acuerdo con el dibujo de ingeniería proporcionado (Figura 1). Impresión 3D de un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) Prepare un modelo de diseño asistido por ordenador (CAD) 3D del molde PDMS utilizando SolidWorks de acuerdo con el…

Representative Results

La adherencia de HUVECs a las regiones de la placa bien no revestida con fibronectin fue abrogada por la pasivación plurónica F-127; el crecimiento se limitó a la región recubierta de fibronectina incluso después de 72 h de cultivo, con y sin aplicación de esfuerzo de cizalladura(Figura 4A, Figura 4C). Sin la pasivación Pluronic F-127, los HUVECs se unieron a la superficie sin fibronectina y habían proliferado aún más p…

Discussion

El método de remolino-pozo es capaz de generar perfiles de flujo complejos en un solo pozo – Flujo multidireccional de baja magnitud (LMMF) en el centro y Flujo uniaxial de alta magnitud (HMUF) en el borde del pozo. Sin embargo, las secreciones mediadas por estrés de cizallamiento del mediador soluble se mezclarán en el medio de remolino y afectarán a las células en todo el pozo, potencialmente enmascarando el verdadero efecto de un perfil particular de esfuerzo de cizallamiento en las células.

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Materials

Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	NA	NA	Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital
Reagents and Materials
Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated	Scientific Laboratory Supplies Ltd	351146
Fibronectin from Bovine Plasma	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Phosphate-Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Recombinant Human TNF-a	Peprotech	300-01A
RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg	RS	832-0264
Stainless Steel 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Silicone Elastomer kit	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody	Cell Signaling Technology	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SHA7930
Leica TCS SP5 Confocal Microscope	Leica	NA
Retaining Ring Pliers	Misumi	RTWP32-58
Retaining Rings/Internal/C-Type	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+3-D printer	Ultimaker	NA
Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA