Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Summary

Descriviamo un metodo per la preparazione e l’imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Abstract

Tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa, gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente strumento basato sull’imaging per lo studio di fenomeni citoplasmatici, come la citochinesi, la formazione del fuso mitotico e l’assemblaggio del nucleo. Basandosi sui primi metodi che riprendevano estratti fissi campionati in punti temporali sparsi, i recenti approcci hanno ottenuto estratti live utilizzando la microscopia time-lapse, rivelando caratteristiche più dinamiche con una risoluzione temporale migliorata. Questi metodi di solito richiedono sofisticati trattamenti superficiali del vaso di imaging. Qui introduciamo un metodo alternativo per l’imaging dal vivo di estratti di uova che non richiedono alcun trattamento chimico superficiale. È semplice da implementare e utilizza materiali di consumo di laboratorio prodotti in serie per l’imaging. Descriviamo un sistema che può essere utilizzato sia per la microscopia a campo largo che per quella confocale. È progettato per l’imaging di estratti in un campo 2-dimensionale (2D), ma può essere facilmente esteso all’imaging in 3D. È adatto per studiare la formazione di modelli spaziali all’interno del citoplasma. Con dati rappresentativi, dimostriamo la tipica organizzazione dinamica di microtubuli, nuclei e mitocondri in estratti interfasici preparati con questo metodo. Questi dati di immagine possono fornire informazioni quantitative sulla dinamica citoplasmatica e sull’organizzazione spaziale.

Introduction

Il citoplasma costituisce il volume principale di una cellula e ha un’organizzazione distinta. Gli ingredienti del citoplasma eucariotico possono auto-assemblarsi in una vasta gamma di strutture spaziali, come gli astri dei microtubuli e l’apparato di Golgi, che a loro volta sono disposti dinamicamente e girati a seconda dell’identità della cellula e dello stato fisiologico. Comprendere l’organizzazione spaziale del citoplasma e il suo legame con le funzioni cellulari è quindi importante per capire come funziona la cellula. Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono stati tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa 1,2,3,4,5,6,7,8, ma recenti lavori li stabiliscono come un potente sistema di imaging dal vivo per studi meccanicistici delle strutture citoplasmatiche e delle loro funzioni cellulari 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Questi estratti non diluiti preservano molte strutture e funzioni del citoplasma, consentendo manipolazioni dirette di contenuti citoplasmatici non ottenibili nei modelli cellulari convenzionali^19,20. Ciò li rende ideali per caratterizzare i fenomeni citoplasmatici e sezionare le loro basi meccanicistiche.

I metodi esistenti per l’imaging degli estratti richiedono modifiche chimiche della superficie o la fabbricazione di dispositivi microfluidici. Un metodo basato su coprivetrini richiede la passivazione al glicole polietilenico (PEG) dei vetrini di vetro²¹. Un metodo basato su microemulsioni richiede la deposizione da vapore di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano su superfici vetrate^22,23. I sistemi basati sulla microfluidica consentono un controllo preciso del volume, della geometria e della composizione delle goccioline di estratto, ma richiedono strutture di microfabbricazione specializzate^11,12,24.

Qui introduciamo un metodo alternativo per l’imaging degli estratti di uova che è facile da implementare e utilizza materiali prontamente disponibili e a basso costo. Ciò include la preparazione di una camera di imaging con un vetrino e un coprivetrino rivestito con nastro fluorurato di etilene propilene (FEP). La camera può essere utilizzata per l’imaging di estratti con una varietà di sistemi di microscopia, tra cui stereoscopi e microscopi verticali e invertiti. Questo metodo non richiede alcun trattamento chimico delle superfici, pur ottenendo una chiarezza ottica simile ottenuta con i metodi esistenti a base di vetro discussi sopra. È progettato per visualizzare uno strato di estratti con uno spessore uniforme su un campo 2D e può essere facilmente esteso per visualizzare un volume 3D di estratti. È adatto per l’imaging time-lapse del comportamento citoplasmatico collettivo su un ampio campo visivo.

Abbiamo utilizzato estratti di uova interfasici per dimostrare il nostro metodo di imaging. La preparazione dell’estratto segue il protocollo di Deming e Kornbluth¹⁹. In breve, le uova naturalmente arrestate in metafase della meiosi II vengono schiacciate da una rotazione a bassa velocità. Questo spin rilascia il citoplasma dall’arresto meiotico e consente all’estratto di procedere in interfase. Normalmente, la citocalasina B viene aggiunta prima dello spin di schiacciamento per inibire la formazione di F-actina. Tuttavia, può essere omesso se si desidera F-actina. La cicloeximide viene anche aggiunta prima dello spin di schiacciamento per impedire all’estratto interfase di entrare nella mitosi successiva. Gli estratti vengono successivamente collocati nelle suddette camere di imaging e posti su un microscopio. Infine, le immagini vengono registrate nel tempo a intervalli definiti da una fotocamera collegata al microscopio, producendo serie di immagini time-lapse che catturano il comportamento dinamico dell’estratto in un campo 2D.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University. 1. Preparazione di diapositive e copertine Applicare uno strato di nastro adesivo fluorurato di etilene propilene (FEP) su un vetrino con un applicatore a rullo. Tagliare il nastro adesivo eccessivo sui bordi con una lama di rasoio pulita. Preparare i coprivetrini rivestiti con nastro FEP nello stesso modo (Figura 1A).</li…

Representative Results

Gli estratti di uovo di Xenopus laevis possono essere utilizzati per studiare l’auto-organizzazione del citoplasma durante l’interfase. La Figura 2A mostra i risultati di un esperimento riuscito. Abbiamo integrato estratti interfasici con nuclei di spermatozoi demembranati di Xenopus laevis 19 ad una concentrazione di 27 nuclei / μL e 0,38 μM purificati GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteina di fusione costituita da glutatione-S-tra…

Discussion

Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente sistema modello per studi basati sull’imaging di varie strutture subcellulari 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organizzazione citoplasmatica nel suo complesso<sup…

Materials

17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22×22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M