Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri
Summary
Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.
Abstract
Geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılan Xenopus laevis yumurta ekstraktları, sitokinezi, mitotik iğ oluşumu ve çekirdeğin montajı gibi sitoplazmik fenomenleri incelemek için güçlü bir görüntüleme tabanlı araç olarak ortaya çıkmıştır. Seyrek zaman noktalarında örneklenen sabit ekstraktları görüntüleyen erken yöntemlere dayanarak, son yaklaşımlar hızlandırılmış mikroskopi kullanarak canlı ekstraktları görüntüleyerek gelişmiş zamansal çözünürlükle daha dinamik özellikler ortaya çıkarır. Bu yöntemler genellikle görüntüleme kabının sofistike yüzey işlemlerini gerektirir. Burada, kimyasal yüzey işlemi gerektirmeyen yumurta ekstraktlarının canlı görüntülenmesi için alternatif bir yöntem sunuyoruz. Uygulanması kolaydır ve görüntüleme için seri üretilen laboratuvar sarf malzemelerini kullanır. Hem geniş alan hem de konfokal mikroskopi için kullanılabilecek bir sistemi tanımlıyoruz. 2 boyutlu (2D) bir alanda ekstraktları görüntülemek için tasarlanmıştır, ancak 3D’de görüntülemeye kolayca genişletilebilir. Sitoplazma içindeki mekansal desen oluşumunu incelemek için çok uygundur. Temsili verilerle, bu yöntem kullanılarak hazırlanan interfaz ekstraktlarında mikrotübüllerin, çekirdeklerin ve mitokondrilerin tipik dinamik organizasyonunu gösteriyoruz. Bu görüntü verileri, sitoplazmik dinamikler ve mekansal organizasyon hakkında nicel bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Sitoplazma, bir hücrenin ana hacmini oluşturur ve ayrı bir organizasyona sahiptir. Ökaryotik sitoplazmanın bileşenleri, mikrotübül asterleri ve Golgi aparatı gibi çok çeşitli mekansal yapılara kendiliğinden toplanabilir ve bunlar da hücrenin kimliğine ve fizyolojik durumuna bağlı olarak dinamik olarak düzenlenir ve döndürülür. Sitoplazmanın mekansal organizasyonunu ve hücresel fonksiyonlara olan bağlantısını anlamak, hücrenin nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Xenopus laevis yumurta ekstraktları geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8, ancak son çalışmalar onları sitoplazmik yapıların mekanik çalışmaları ve hücresel fonksiyonları için güçlü bir canlı görüntüleme sistemi olarak kurmaktadır 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Bu seyreltilmemiş ekstraktlar, sitoplazmanın birçok yapısını ve fonksiyonunu korurken, geleneksel hücre bazlı modellerde elde edilemeyen sitoplazmik içeriğin doğrudan manipülasyonlarına izin verir19,20. Bu, onları sitoplazmik fenomenleri karakterize etmek ve mekanik temellerini incelemek için ideal kılar.
Ekstraktları görüntülemek için mevcut yöntemler, kimyasal yüzey modifikasyonları veya mikroakışkan cihazların üretilmesini gerektirir. Bir coverslip bazlı yöntem, cam kapakların polietilen glikol (PEG) pasivasyonunu gerektirir21. Mikroemülsiyon bazlı bir yöntem, trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silanın cam yüzeylerde buhar birikimini gerektirir22,23. Mikroakışkan tabanlı sistemler, ekstrakt damlacıklarının hacminin, geometrisinin ve bileşiminin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, ancak özel mikrofabrikasyon tesisleri gerektirir11,12,24.
Burada, yumurta ekstraktlarını görüntülemek için uygulaması kolay ve kolayca temin edilebilen, düşük maliyetli malzemeler kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Bu, bir slayt ve florlu etilen propilen (FEP) bant ile kaplanmış bir kapak kapağı ile bir görüntüleme odasının hazırlanmasını içerir. Oda, stereoskoplar ve dik ve ters mikroskoplar dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi sistemleriyle ekstraktları görüntülemek için kullanılabilir. Bu yöntem, yukarıda tartışılan mevcut cam bazlı yöntemlerle elde edilen benzer optik netliği elde ederken yüzeylerin kimyasal olarak işlenmesini gerektirmez. Bir 2B alan boyunca eşit kalınlığa sahip bir ekstrakt katmanını görüntülemek için tasarlanmıştır ve 3B ekstrakt hacmini görüntülemek için kolayca genişletilebilir. Geniş bir görüş alanı üzerinde kolektif sitoplazmik davranışın hızlandırılmış görüntülenmesi için çok uygundur.
Görüntüleme yöntemimizi göstermek için interfaz tutuklamalı yumurta ekstraktları kullandık. Ekstrakt preparatı, Deming ve Kornbluth19 protokolünü takip eder. Kısacası, mayoz II’nin metafazında doğal olarak tutuklanan yumurtalar, düşük hızlı bir spin ile ezilir. Bu spin, sitoplazmayı mayotik arrestten serbest bırakır ve ekstraktın interfaza geçmesine izin verir. Normalde, F-aktin oluşumunu inhibe etmek için ezme spininden önce sitokalasin B eklenir. Bununla birlikte, F-aktin isteniyorsa atlanabilir. Sikloheksimid, interfaz ekstraktının bir sonraki mitoza girmesini önlemek için ezme spininden önce de eklenir. Ekstraktlar daha sonra yukarıda belirtilen görüntüleme odalarına yerleştirilir ve mikroskop üzerine yerleştirilir. Son olarak, görüntüler mikroskopa bağlı bir kamera tarafından belirli aralıklarla zaman içinde kaydedilir ve 2D alanda ekstraktın dinamik davranışını yakalayan hızlandırılmış görüntü serileri üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis yumurta ekstreleri, çeşitli hücre altı yapıların 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 ve bir bütün olarak sitoplazmik organizasyonun görüntülenmesine dayalı çalışmalar için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Kamenz, Y. Chen ve W. Y. C. Huang’a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, James E. Ferrell, Jr.’a verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R01 GM110564, P50 GM107615 ve R35 GM131792) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
