Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica
Summary
Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .
Abstract
Tradicionalmente usados para ensaios bioquímicos a granel, os extratos de ovos de Xenopus laevis surgiram como uma poderosa ferramenta baseada em imagens para estudar fenômenos citoplasmáticos, como citocinese, formação de fuso mitótico e montagem do núcleo. Com base nos primeiros métodos que visualizavam extratos fixos amostrados em pontos de tempo esparsos, abordagens recentes de extratos ao vivo de imagem usando microscopia de lapso de tempo, revelando características mais dinâmicas com resolução temporal aprimorada. Esses métodos geralmente requerem tratamentos de superfície sofisticados do vaso de imagem. Aqui apresentamos um método alternativo para imagens vivas de extratos de ovos que não requerem tratamento químico de superfície. É simples de implementar e utiliza consumíveis de laboratório produzidos em massa para imagens. Descrevemos um sistema que pode ser usado tanto para microscopia de campo amplo quanto para microscopia confocal. Ele é projetado para extratos de imagem em um campo 2-dimensional (2D), mas pode ser facilmente estendido para imagens em 3D. É bem adequado para estudar a formação de padrões espaciais dentro do citoplasma. Com dados representativos, demonstramos a organização dinâmica típica de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em extratos interfásicos preparados usando este método. Esses dados de imagem podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica citoplasmática e a organização espacial.
Introduction
O citoplasma constitui o volume principal de uma célula e tem uma organização distinta. Os ingredientes do citoplasma eucariótico podem se auto-montar em uma ampla gama de estruturas espaciais, como as ásteres de microtúbulos e o aparelho de Golgi, que por sua vez são dinamicamente dispostos e transformados dependendo da identidade da célula e do estado fisiológico. Compreender a organização espacial do citoplasma e sua ligação com as funções celulares é, portanto, importante para entender como a célula funciona. Os extratos de ovos de Xenopus laevis têm sido tradicionalmente utilizados para ensaios bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, mas trabalhos recentes os estabelecem como um poderoso sistema de imagem viva para estudos mecanicistas de estruturas citoplasmáticas e suas funções celulares 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Esses extratos não diluídos preservam muitas estruturas e funções do citoplasma, ao mesmo tempo em que permitem manipulações diretas de conteúdo citoplasmático não alcançáveis em modelos convencionais baseados em células19,20. Isso os torna ideais para caracterizar fenômenos citoplasmáticos e dissecar seus fundamentos mecanicistas.
Os métodos existentes para extratos de imagem requerem modificações químicas de superfície ou fabricação de dispositivos microfluídicos. Um método baseado em deslizamento de cobertura requer a passivação de polietilenoglicol (PEG) de coberturas de vidro21. Um método baseado em microemulsão requer a deposição de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em superfícies de vidro22,23. Os sistemas de base microfluídica permitem o controle preciso do volume, geometria e composição das gotículas de extrato, mas requerem instalações especializadas de microfabricação 11,12,24.
Aqui apresentamos um método alternativo para a imagem de extratos de ovos que é fácil de implementar e utiliza materiais prontamente disponíveis e de baixo custo. Isso inclui a preparação de uma câmara de imagem com uma lâmina e uma folha de cobertura revestida com fita fluorada de etileno propileno (FEP). A câmara pode ser usada para extratos de imagem com uma variedade de sistemas de microscopia, incluindo estereoscópios e microscópios verticais e invertidos. Este método não requer tratamento químico de superfícies, ao mesmo tempo em que alcança clareza óptica semelhante obtida com os métodos existentes à base de vidro discutidos acima. Ele é projetado para criar imagens de uma camada de extratos com uma espessura uniforme em um campo 2D e pode ser facilmente estendido para visualizar um volume 3D de extratos. É bem adequado para imagens de lapso de tempo do comportamento citoplasmático coletivo em um grande campo de visão.
Usamos extratos de ovos presos entre fases para demonstrar nosso método de imagem. A preparação do extrato segue o protocolo de Deming e Kornbluth19. Resumidamente, os ovos naturalmente presos na metáfase da meiose II são esmagados por um giro de baixa velocidade. Este spin libera o citoplasma da parada meiótica e permite que o extrato prossiga para a interfase. Normalmente, a citocalasina B é adicionada antes do spin de esmagamento para inibir a formação de F-actina. No entanto, pode ser omitido se a F-actina for desejada. A cicloheximida também é adicionada antes do spin de esmagamento para evitar que o extrato interfásico entre na próxima mitose. Os extratos são posteriormente colocados nas câmaras de imagem acima mencionadas e colocados em um microscópio. Finalmente, as imagens são gravadas ao longo do tempo em intervalos definidos por uma câmera conectada ao microscópio, produzindo séries de imagens de lapso de tempo que capturam o comportamento dinâmico da extração em um campo 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os extratos de ovos de Xenopus laevis emergiram como um poderoso sistema modelo para estudos baseados em imagens de várias estruturas subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organização citoplasmática em um todo<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) concedidas a James E. Ferrell, Jr.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
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