Xenopus laevis Подготовка экстракта яйцеклеток и методы визуализации в реальном времени для визуализации динамической цитоплазматической организации
Summary
Описан способ получения и живой визуализации неразбавленных цитоплазматических экстрактов из яиц Xenopus laevis .
Abstract
Традиционно используемые для объемных биохимических анализов, экстракты яиц Xenopus laevis стали мощным инструментом на основе визуализации для изучения цитоплазматических явлений, таких как цитокинез, формирование митотического веретена и сборка ядра. Основываясь на ранних методах, которые изображали фиксированные экстракты, отобранные в редкие временные точки, последние подходы изображают живые экстракты с использованием покадровой микроскопии, выявляя более динамические особенности с улучшенным временным разрешением. Эти методы обычно требуют сложной обработки поверхности сосуда визуализации. Здесь мы представляем альтернативный метод живой визуализации экстрактов яиц, которые не требуют химической обработки поверхности. Он прост в реализации и использует серийные лабораторные расходные материалы для визуализации. Описана система, которая может быть использована как для широкоугольной, так и для конфокальной микроскопии. Он предназначен для визуализации экстрактов в 2-мерном (2D) поле, но может быть легко расширен до визуализации в 3D. Он хорошо подходит для изучения формирования пространственного рисунка в цитоплазме. С репрезентативными данными мы демонстрируем типичную динамическую организацию микротрубочек, ядер и митохондрий в интерфазных экстрактах, приготовленных с использованием этого метода. Эти данные изображения могут предоставить количественную информацию о цитоплазматической динамике и пространственной организации.
Introduction
Цитоплазма составляет основной объем клетки и имеет четкую организацию. Ингредиенты эукариотической цитоплазмы могут самособираться в широкий спектр пространственных структур, таких как микротрубочки и аппарат Гольджи, которые, в свою очередь, динамически располагаются и переворачиваются в зависимости от идентичности клетки и физиологического состояния. Таким образом, понимание пространственной организации цитоплазмы и ее связи с клеточными функциями важно для понимания того, как работает клетка. Экстракты яиц Xenopus laevis традиционно использовались для объемных биохимических анализов 1,2,3,4,5,6,7,8, но недавняя работа устанавливает их как мощную живую систему визуализации для механистических исследований цитоплазматических структур и их клеточных функций 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Эти неразбавленные экстракты сохраняют многие структуры и функции цитоплазмы, позволяя при этом прямые манипуляции с цитоплазматическим содержимым, недостижимые в обычных клеточных моделях19,20. Это делает их идеальными для характеристики цитоплазматических явлений и препарирования их механистических основ.
Существующие методы визуализации экстрактов требуют химической модификации поверхности или изготовления микрофлюидных устройств. Один метод на основе чехла требует пассивации полиэтиленгликолем (ПЭГ) стеклянных покровных пластин21. Метод, основанный на микроэмульсии, требует осаждения из пара трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана на стеклянных поверхностях22,23. Системы на основе микрофлюидов позволяют точно контролировать объем, геометрию и состав капель экстракта, но требуют специализированных средств микропроизводства 11,12,24.
Здесь мы представляем альтернативный метод визуализации экстрактов яиц, который прост в реализации и использует легкодоступные, недорогие материалы. Это включает в себя подготовку камеры визуализации с затвором и крышкой, покрытой фторированной этиленпропиленовой лентой (FEP). Камера может быть использована для визуализации экстрактов с различными системами микроскопии, включая стереоскопы и вертикальные и инвертированные микроскопы. Этот метод не требует химической обработки поверхностей при достижении аналогичной оптической чистоты, полученной с помощью существующих методов на основе стекла, рассмотренных выше. Он предназначен для изображения слоя экстрактов с равномерной толщиной в 2D-поле и может быть легко расширен для изображения 3D-объема экстрактов. Он хорошо подходит для покадровой визуализации коллективного цитоплазматического поведения в большом поле зрения.
Мы использовали экстракты яиц с межфазным арестом, чтобы продемонстрировать наш метод визуализации. Подготовка экстракта осуществляется в соответствии с протоколом Деминга и Корнблута19. Короче говоря, яйца, естественно остановленные в метафазе мейоза II, измельчаются низкоскоростным вращением. Этот спин освобождает цитоплазму от мейотического ареста и позволяет экстракту переходить в интерфазу. Обычно цитохалазин B добавляют перед дробильным спином для ингибирования образования F-актина. Тем не менее, он может быть опущен, если требуется F-актин. Циклогексимид также добавляют перед дробильным спином, чтобы предотвратить попадание межфазного экстракта в следующий митоз. Экстракты впоследствии помещают в вышеупомянутые камеры визуализации и помещают на микроскоп. Наконец, изображения записываются с течением времени через определенные промежутки времени камерой, подключенной к микроскопу, создавая покадровые серии изображений, которые фиксируют динамическое поведение экстракта в 2D-поле.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экстракты яиц Xenopus laevis стали мощной модельной системой для визуализационных исследований различных субклеточных структур 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 и цитоплазматической организации в целом </sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим J. Kamenz, Y. Chen и W. Y. C. Huang за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R01 GM110564, P50 GM107615 и R35 GM131792), присужденными Джеймсу Э. Ферреллу-младшему.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
