Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Summary

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Abstract

Onze steeds ouder wordende samenleving leidt tot een groeiende incidentie van neurodegeneratieve ziekten. Tot nu toe zijn de pathologische mechanismen onvoldoende begrepen, waardoor de vaststelling van gedefinieerde behandelingen wordt belemmerd. Celgebaseerde additieve gentherapieën voor de verhoogde expressie van een beschermende factor worden beschouwd als een veelbelovende optie om neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), te mediteren. We hebben een methode ontwikkeld voor de stabiele expressie van het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), die wordt gekenmerkt als een neuroprotectief en anti-angiogeen eiwit in het zenuwstelsel, in het genoom van primaire menselijke pigmentepitheelcellen (PE) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Primaire PE-cellen werden geïsoleerd uit menselijke donorogen en in cultuur gehouden. Na het bereiken van confluence werden 1 x 10⁴ cellen gesuspendeerd in 11 μL resuspensiebuffer en gecombineerd met 2 μL van een gezuiverde oplossing met 30 ng hyperactief SB (SB100X) transposaseplasmide en 470 ng PEDF transposonplasmide. Genetische modificatie werd uitgevoerd met een capillair elektroporatiesysteem met behulp van de volgende parameters: twee pulsen met een spanning van 1.100 V en een breedte van 20 ms. Getransfecteerde cellen werden overgebracht in kweekplaten met medium aangevuld met foetaal runderserum; antibiotica en antimycotica werden toegevoegd met de eerste medium uitwisseling. Succesvolle transfectie werd aangetoond in onafhankelijk uitgevoerde experimenten. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) toonde de verhoogde expressie van het PEDF-transgen . PEDF-secretie was significant verhoogd en bleef stabiel, zoals geëvalueerd door immunoblotting en gekwantificeerd door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-gemedieerde overdracht zorgde voor een stabiele PEDF-genintegratie in het genoom van PE-cellen en zorgde voor de continue afscheiding van PEDF, wat van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van een celgebaseerde gentoevoegingstherapie voor de behandeling van AMD of andere retinale degeneratieve ziekten. Bovendien wees analyse van het integratieprofiel van het PEDF-transposon in menselijke PE-cellen op een bijna willekeurige genomische verdeling.

Introduction

Gevorderde leeftijd wordt beschreven als het belangrijkste risico voor neurodegeneratieve ziekten. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene ziekte die leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen bij patiënten ouder dan 60 jaar, behoort tot de vier meest voorkomende oorzaken van blindheid en slechtziendheid¹ en zal naar verwachting toenemen tot 288 miljoen mensen in 2040². Disfuncties van het retinale pigmentepitheel (RPE), een enkele laag dicht opeengepakte cellen tussen de choriocapillaris en de retinale fotoreceptoren, dragen bij aan de pathogenese van AMD. De RPE vervult meerdere taken die essentieel zijn voor een normale retinale functie³ en scheidt een verscheidenheid aan groeifactoren en factoren af die essentieel zijn om de structurele integriteit van het netvlies en de choriocapillaris te behouden, waardoor de overleving van de fotoreceptor wordt ondersteund en een basis wordt gelegd voor de circulatie en de toevoer van voedingsstoffen.

In gezonde ogen is pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) verantwoordelijk voor het balanceren van de effecten van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) en beschermt neuronen tegen apoptose, voorkomt proliferatie van endotheelcellen en stabiliseert het capillaire endotheel. Een verschoven VEGF-pedf-verhouding is gerelateerd aan oculaire neovascularisatie, die werd waargenomen in diermodellen ^4,5 en in monsters van patiënten met choroïdale neovascularisatie (CNV) als gevolg van AMD en proliferatieve diabetische retinopathie ^6,7,8,9,10 . De verhoogde VEGF-concentratie is het doel voor de huidige standaardbehandeling. De anti-VEGF-geneesmiddelen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept en, meest recent, brolucizumab verbeteren de gezichtsscherpte bij ongeveer een derde van de CNV-patiënten of stabiliseren het gezichtsvermogen in 90% van de gevallen 11,12,13. De frequente, vaak maandelijkse, intravitreale injecties dragen echter het risico op bijwerkingen¹⁴, tasten de therapietrouw van de patiënt aan en vormen een aanzienlijke economische last voor de gezondheidszorgstelsels¹⁵. Bovendien reageert een bepaald percentage van de patiënten (2%-20%) niet of slechts slecht op de anti-VEGF-therapie 16,17,18,19. Deze negatieve gelijktijdige factoren vereisen de ontwikkeling van alternatieve behandelingen, bijvoorbeeld intraoculaire implantaten, cel- en/of gentherapeutische benaderingen.

Gentherapie is geëvolueerd als veelbelovende behandeling voor erfelijke en niet-erfelijke ziekten en is bedoeld om niet-functionele gensequenties te herstellen of slecht functionerende te onderdrukken. Voor polygene ziekten, waarbij identificatie en vervanging van de oorzakelijke factoren nauwelijks mogelijk is, streven strategieën naar de continue levering van een beschermende factor. In het geval van AMD zijn verschillende additieve therapieën ontwikkeld, zoals de stabiele expressie van endostatine en angiostatine²⁰, de VEGF-antagonist oplosbare fms-achtige tyrosinekinase-1 (sFLT-1)^21,22, het complementregulerende eiwitcluster van differentiatie 59 (CD59)²³ of PEDF^24,25 . Het oog, en vooral het netvlies, is een uitstekend doelwit voor een op genen gebaseerd medicijn vanwege de gesloten structuur, goede toegankelijkheid, kleine omvang en immuunprivilege, waardoor een gelokaliseerde levering van lage therapeutische doses mogelijk is en transplantaties minder vatbaar zijn voor afstoting. Bovendien maakt het oog niet-invasieve monitoring mogelijk en kan het netvlies worden onderzocht met verschillende beeldvormingstechnieken.

Virale vectoren zijn, vanwege hun hoge transductie-efficiëntie, het belangrijkste voertuig om therapeutische genen in doelcellen af te leveren. Afhankelijk van de gebruikte virale vector zijn echter verschillende bijwerkingen beschreven, zoals immuun- en ontstekingsreacties²⁶, mutagene en oncogene effecten^27,28 of verspreiding in andere weefsels²⁹. Praktische beperkingen zijn onder meer een beperkte verpakkingsgrootte³⁰ en moeilijkheden en kosten in verband met de productie van partijen^31,32 van klinische kwaliteit. Deze nadelen hebben de verdere ontwikkeling bevorderd van niet-virale, op plasmide gebaseerde vectoren die worden overgedragen via lipo-/polyplexen, echografie of elektroporatie. Genomische integratie van het transgen in het gastheergenoom wordt echter meestal niet bevorderd met plasmidevectoren, wat resulteert in een voorbijgaande expressie.

Transposons zijn natuurlijk voorkomende DNA-fragmenten die hun positie in het genoom veranderen, een kenmerk dat is aangenomen voor gentherapie. Dankzij een actief integratiemechanisme zorgen transposon-gebaseerde vectorsystemen voor een continue en constante expressie van het ingebrachte transgen. Het Sleeping Beauty (SB) transposon, gereconstitueerd uit een oud Tc1/mariner-type transposon gevonden in vis³³ en verder verbeterd door moleculaire evolutie resulterend in de hyperactieve variant SB100X³⁴, maakte efficiënte transpositie in verschillende primaire cellen mogelijk en werd gebruikt voor de fenotypische correctie in verschillende ziektemodellen³⁵. Op dit moment zijn 13 klinische onderzoeken gestart met behulp van het SB transposon systeem. Het SB100X transposon systeem bestaat uit twee componenten: het transposon, dat bestaat uit het gen van belang geflankeerd door terminale inverted repeats (TIRs), en het transposase, dat het transposon mobiliseert. Na plasmide-DNA-levering aan de cellen bindt het transposase de TIRs en katalyseert het de excisie en integratie van het transposon in het genoom van de cel.

We hebben een niet-virale celgebaseerde additieve therapie ontwikkeld voor de behandeling van neovasculaire LMD. De aanpak omvat de op elektroporatie gebaseerde insertie van het PEDF-gen in primaire pigmentepitheelcellen (PE) door middel van het SB100X transposonsysteem 36,37,38. De genetische informatie van de transposase en PEDF wordt verstrekt op afzonderlijke plasmiden, waardoor de ideale SB100X-PEDF-transposonverhouding kan worden aangepast. Elektroporatie wordt uitgevoerd met behulp van een op pipet gebaseerd capillair transfectiesysteem dat wordt gekenmerkt door een maximale spleetgrootte tussen de elektroden terwijl hun oppervlak wordt geminimaliseerd. Het apparaat bleek uitstekende transfectiesnelheden te bereiken in een breed scala van zoogdiercellen 39,40,41. Het kleine elektrodeoppervlak zorgt voor een uniform elektrisch veld en vermindert de verschillende bijwerkingen van elektrolyse⁴².

De anti-angiogene functionaliteit van PEDF uitgescheiden door getransfecteerde pigmentepitheelcellen werd aangetoond in verschillende in vitro experimenten die het kiemen, migreren en apoptose van menselijke navelstrenga-endotheelcellen analyseerden⁴³. Bovendien vertoonde transplantatie van PEDF-getransfecteerde cellen in een konijnenmodel van cornea-neovascularisatie⁴⁴ en een rattenmodel van CNV 43,45,46 een afname van neovascularisatie.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de stabiele insertie van het PEDF-gen in primaire menselijke RPE-cellen via het SB100X-transposonsysteem met behulp van een capillair transfectiesysteem. De getransfecteerde cellen werden gedurende 21 dagen in cultuur gehouden en vervolgens geanalyseerd in termen van PEDF-genexpressie door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en in termen van PEDF-eiwitsecretie door immunoblotting en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA, figuur 1).

Protocol

Menselijke donorogen werden verkregen van de Aachen Cornea Bank van de afdeling Oogheelkunde (Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Protocollen van de Verklaring van Helsinki. Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke monsters zijn goedgekeurd door de institutionele ethische commissie. 1. Isolatie van primaire menselijke RPE-cellen Leg steriele beschermende kleding en handschoenen neer. Plaats …

Representative Results

Teelt en elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellenWe hebben aangetoond dat het zaaien van een voldoende aantal primaire RPE-cellen van dierlijke oorsprong de teelt en groei mogelijk maakt tot een geïntegreerde monolaag van gepigmenteerde, zeshoekig gevormde cellen 36,37,48. Hun vermogen om tight junctions te vormen, fagocytische activiteit te vertonen en specifieke m…

Discussion

In ons project streven we naar de niet-virale productie van genetisch gemodificeerde primaire menselijke RPE-cellen die voortdurend overexpressie en afscheiding van een effectieve factor om de getransfecteerde cellen te gebruiken als langetermijntherapeutisch middel voor het creëren en onderhouden van een beschermende omgeving. We hebben de introductie vastgesteld van het gen dat codeert voor PEDF, een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multifunctioneel eiwit met anti-angiogene en neuroprotectieve functies. Het hie…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054