Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu
Summary
Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.
Abstract
Giderek yaşlanan toplumumuz, nörodejeneratif hastalıkların artan insidansına yol açmaktadır. Şimdiye kadar, patolojik mekanizmalar yeterince anlaşılmamış, bu nedenle tanımlanmış tedavilerin kurulmasını engellemiştir. Koruyucu bir faktörün artan ekspresyonu için hücre bazlı katkı gen tedavileri, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için umut verici bir seçenek olarak kabul edilir. Sinir sisteminde nöroprotektif ve anti-anjiyojenik bir protein olarak karakterize edilen pigment epitel kaynaklı faktörü (PEDF) kodlayan genin, Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak primer insan pigment epitel (PE) hücrelerinin genomuna stabil ekspresyonu için bir yöntem geliştirdik. Primer PE hücreleri insan donör gözlerinden izole edildi ve kültürde tutuldu. Birleşmeye ulaştıktan sonra, 11 μL resüspansiyon tamponunda 1 x 104 hücre askıya alındı ve 30 ng hiperaktif SB (SB100X) transpozaz plazmidi ve 470 ng PEDF transpozon plazmidi içeren 2 μL saflaştırılmış bir çözelti ile birleştirildi. Genetik modifikasyon, aşağıdaki parametreler kullanılarak kılcal bir elektroporasyon sistemi ile gerçekleştirildi: 1.100 V voltajlı ve 20 ms genişliğinde iki darbe. Transfekte hücreler, fetal sığır serumu ile desteklenmiş ortam içeren kültür plakalarına aktarıldı; antibiyotikler ve antimikotikler ilk orta değişim ile eklendi. Başarılı transfeksiyon bağımsız olarak yapılan deneylerde gösterilmiştir. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), PEDF transgeninin artmış ekspresyonunu gösterdi. PEDF sekresyonu, immünoblotlama ile değerlendirildiği ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldüğü gibi anlamlı derecede yükselmiş ve stabil kalmıştır. SB100X aracılı transfer, PE hücrelerinin genomuna stabil bir PEDF gen entegrasyonuna izin verdi ve AMD veya diğer retinal dejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hücre bazlı bir gen ekleme tedavisinin geliştirilmesi için kritik olan PEDF’nin sürekli salgılanmasını sağladı. Dahası, PEDF transpozonunun insan PE hücrelerine entegrasyon profilinin analizi, neredeyse rastgele bir genomik dağılım olduğunu göstermiştir.
Introduction
İleri yaş, nörodejeneratif hastalıklar için ana risk olarak tanımlanmaktadır. 60 yaşından büyük hastalarda ciddi görme kaybına yol açan poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), körlük ve görme bozukluğunun en yaygın dört nedenine aittir1 ve 2040 yılında 288 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir2. Koryokapillaris ve retinal fotoreseptörler arasında sıkıca paketlenmiş hücrelerin tek bir tabakası olan retinal pigment epitelinin (RPE) disfonksiyonları, AMD’nin patogenezine katkıda bulunur. RPE, normal bir retina fonksiyonu3 için gerekli olan birçok görevi yerine getirir ve retinanın ve koryokapilarisin yapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan çeşitli büyüme faktörlerini ve faktörlerini salgılar, böylece fotoreseptör sağkalımını destekler ve dolaşım ve besin tedariki için bir temel sağlar.
Sağlıklı gözlerde, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF), vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) etkilerini dengelemekten sorumludur ve nöronları apoptoza karşı korur, endotel hücre proliferasyonunu önler ve kılcal endoteli stabilize eder. Değişmiş bir VEGF-PEDF oranı, hayvan modelleri 4,5’te ve AMD ve proliferatif diyabetik retinopatiye bağlı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) olan hastaların örneklerinde gözlenen oküler neovaskülarizasyon ile ilişkilidir 6,7,8,9,10 . Gelişmiş VEGF konsantrasyonu, mevcut standart tedavinin hedefidir. Anti-VEGF farmasötikler bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ve en son brolucizumab CNV hastalarının yaklaşık üçte birinde görme keskinliğini arttırır veya vakaların% 90’ında görmeyi stabilize eder11,12,13. Bununla birlikte, sıklıkla, genellikle aylık intravitreal enjeksiyonlar, advers olay riski taşır14, hasta uyumunu bozar ve sağlık sistemleri için önemli bir ekonomik yük oluşturur15. Ayrıca, hastaların belirli bir yüzdesi (% 2-% 20) anti-VEGF tedavisine cevap vermemekte veya sadece zayıf tepki vermektedir16,17,18,19. Bu negatif eşlik edenler, göz içi implantlar, hücre ve/veya gen terapötik yaklaşımlar gibi alternatif tedavilerin geliştirilmesini gerektirmektedir.
Gen terapisi, kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalıklar için umut verici bir tedavi olarak gelişmiştir ve fonksiyonel olmayan gen dizilerini restore etmeyi veya arızalı olanları bastırmayı amaçlamaktadır. Etken faktörlerin tanımlanması ve değiştirilmesinin pek mümkün olmadığı poligenik hastalıklar için, stratejiler koruyucu bir faktörün sürekli olarak verilmesini amaçlamaktadır. AMD durumunda, endostatin ve anjiyostatin20’nin kararlı ekspresyonu, VEGF antagonisti çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT-1) 21,22, farklılaşmanın tamamlayıcı düzenleyici protein kümesi 59 (CD59)23 veya PEDF24,25 gibi çeşitli katkı tedavileri geliştirilmiştir. . Göz ve özellikle retina, kapalı yapısı, iyi erişilebilirliği, küçük boyutu ve bağışıklık ayrıcalığı nedeniyle gen bazlı bir ilaç için mükemmel bir hedeftir, böylece düşük terapötik dozların lokalize bir şekilde verilmesine izin verir ve nakillerin reddedilmeye daha az duyarlı hale getirilmesine izin verir. Ayrıca, göz non-invaziv izlemeye olanak tanır ve retina farklı görüntüleme teknikleri ile incelenebilir.
Viral vektörler, yüksek transdüksiyon verimlilikleri nedeniyle, terapötik genleri hedef hücrelere iletmek için ana araçtır. Bununla birlikte, kullanılan viral vektöre bağlı olarak, immün ve inflamatuar yanıtlar26, mutajenik ve onkojenik etkiler 27,28 veya diğer dokularda yayılma29 gibi farklı advers reaksiyonlar tanımlanmıştır. Pratik sınırlamalar arasında sınırlı bir ambalaj boyutu30’un yanı sıra31,32 klinik sınıf lotlarının üretimi ile ilgili zorluklar ve maliyetler bulunmaktadır. Bu dezavantajlar, lipo / polipleksler, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılan viral olmayan, plazmid bazlı vektörlerin daha da geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bununla birlikte, transgenin konakçı genomuna genomik entegrasyonu genellikle plazmid vektörleri ile desteklenmez, böylece geçici bir ekspresyon ile sonuçlanır.
Transpozonlar, genom içindeki konumlarını değiştiren doğal olarak oluşan DNA fragmanlarıdır, bu da gen terapisi için benimsenmiş bir özelliktir. Aktif bir entegrasyon mekanizması nedeniyle, transpozon tabanlı vektör sistemleri, yerleştirilen transgenin sürekli ve sabit bir ifadesine izin verir. Uyuyan Güzel (SB) transpozonu, balık33’te bulunan eski bir Tc1 / denizci tipi transpozondan yeniden oluşturulmuş ve hiperaktif varyant SB100X34 ile sonuçlanan moleküler evrimle daha da geliştirilmiş, çeşitli birincil hücrelerde verimli transpozisyon sağlamıştır ve farklı hastalık modellerinde fenotipik düzeltme için kullanılmıştır35. Şu anda, SB transpozon sistemi kullanılarak 13 klinik çalışma başlatılmıştır. SB100X transpozon sistemi iki bileşenden oluşur: terminal ters çevrilmiş tekrarlar (TIR’lar) tarafından kuşatılan ilgi genini içeren transpozon ve transpozonu harekete geçiren transpozaz. Plazmid DNA’sının hücrelere verilmesini takiben, transpozaz TIR’ları bağlar ve transpozonun eksizyonunu ve hücrenin genomuna entegrasyonunu katalize eder.
Neovasküler AMD tedavisi için viral olmayan hücre bazlı bir katkı maddesi tedavisi geliştirdik. Yaklaşım, PEDF geninin SB100X transpozon sistemi 36,37,38 aracılığıyla primer pigment epitel (PE) hücrelerine elektroporasyon bazlı yerleştirilmesini içerir. Transpozaz ve PEDF’nin genetik bilgisi ayrı plazmidler üzerinde sağlanır, böylece ideal SB100X-PEDF transpozon oranının ayarlanmasını sağlar. Elektroporasyon, yüzey alanlarını en aza indirirken elektrotlar arasında maksimum boşluk boyutu ile karakterize edilen pipet bazlı bir kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Cihazın çok çeşitli memeli hücrelerinde mükemmel transfeksiyon oranları elde ettiği gösterilmiştir 39,40,41. Küçük elektrot yüzey alanı düzgün bir elektrik alanı sağlar ve elektroliz42’nin çeşitli yan etkilerini azaltır.
Transfekte pigment epitel hücreleri tarafından salgılanan PEDF’nin anti-anjiyojenik işlevselliği, insan göbek damarı endotel hücrelerinin filizlenme, göç ve apoptozunu analiz eden çeşitli in vitro deneylerde gösterilmiştir43. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonunun tavşan modelinde PEDF-transfekte hücrelerin transplantasyonu44 ve CNV 43,45,46’nın sıçan modelinde neovaskülarizasyonun azaldığını göstermiştir.
Burada, kılcal transfeksiyon sistemi kullanarak SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Transfekte edilen hücreler 21 gün boyunca kültürde tutuldu ve daha sonra kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile PEDF gen ekspresyonu ve immünoblotasyon ve enzime bağlı immünosorbent testi ile PEDF protein sekresyonu açısından analiz edildi (ELISA, Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Projemizde, transfekte edilen hücrelerin koruyucu bir ortamın kurulması ve sürdürülmesi için uzun süreli terapötik olarak kullanılması amacıyla sürekli olarak aşırı eksprese edilen ve etkili bir faktör salgılayan genetiği değiştirilmiş primer RPE hücrelerinin viral olmayan üretimini hedefliyoruz. Anti-anjiyojenik ve nöroprotektif fonksiyonlara sahip, her yerde eksprese edilen çok fonksiyonlu bir protein olan PEDF’yi kodlayan genin tanıtımını yaptık. Burada açıklanan protokol, SB100X</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin araştırma, teknolojik geliştirme ve gösterim için Yedinci Çerçeve Programı, 305134 no’lu hibe anlaşması ile desteklenmiştir. Zsuzsanna Izsvák, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) tarafından finanse edildi. Yazarlar, mükemmel teknik destek için Anna Dobias ve Antje Schiefer’e (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) ve insan donör gözlerini sağladıkları için Aachen Cornea Bank’a (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) teşekkür eder.
Materials
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
References
- James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
- Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
- Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
- Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
- Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
- Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
- Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
- Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
- Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
- Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
- Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
- Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
- Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina – The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
- Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
- Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
- Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
- Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
- Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
- Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
- Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
- Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
- van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
- Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
- May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C – Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
- Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
- Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
- Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
- Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
- Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
