Modification génétique basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant

Summary

Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Abstract

Notre société de plus en plus vieillissante entraîne une incidence croissante de maladies neurodégénératives. Jusqu’à présent, les mécanismes pathologiques sont mal compris, ce qui empêche la mise en place de traitements définis. Les thérapies géniques additives cellulaires pour l’expression accrue d’un facteur de protection sont considérées comme une option prometteuse pour traiter les maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous avons développé une méthode pour l’expression stable du gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), qui est caractérisé comme une protéine neuroprotectrice et anti-angiogénique dans le système nerveux, dans le génome des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires (PE) en utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). Les cellules PE primaires ont été isolées des yeux de donneurs humains et maintenues en culture. Après avoir atteint la confluence, 1 x 10⁴ cellules ont été suspendues dans 11 μL de tampon de remise en suspension et combinées avec 2 μL d’une solution purifiée contenant 30 ng de plasmide transposase SB hyperactif (SB100X) et 470 ng de plasmide de transposon PEDF . La modification génétique a été réalisée avec un système d’électroporation capillaire utilisant les paramètres suivants: deux impulsions d’une tension de 1 100 V et d’une largeur de 20 ms. Les cellules transfectées ont été transférées dans des plaques de culture contenant un milieu complété par du sérum fœtal bovin; Des antibiotiques et des antimycotiques ont été ajoutés avec le premier échange de milieu. Une transfection réussie a été démontrée dans des expériences réalisées indépendamment. La réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) a montré l’expression accrue du transgène PEDF . La sécrétion de PEDF était significativement élevée et restait stable, telle qu’évaluée par immunoblotting, et quantifiée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Le transfert médié par SB100X a permis une intégration stable du gène PEDF dans le génome des cellules PE et a assuré la sécrétion continue de PEDF , ce qui est essentiel pour le développement d’une thérapie génique à base de cellules pour traiter la DMLA ou d’autres maladies dégénératives de la rétine. De plus, l’analyse du profil d’intégration du transposon PEDF dans les cellules PE humaines a indiqué une distribution génomique presque aléatoire.

Introduction

L’âge avancé est décrit comme le principal risque de maladies neurodégénératives. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique entraînant une perte de vision sévère chez les patients âgés de plus de 60 ans, fait partie des quatre causes les plus fréquentes de cécité et de déficience visuelle¹ et devrait atteindre 288 millions de personnes en 2040². Les dysfonctionnements de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une couche unique de cellules étroitement emballées situées entre le choriocapillaris et les photorécepteurs rétiniens, contribuent à la pathogenèse de la DMLA. L’EPR remplit de multiples tâches essentielles à une fonction rétinienne normale³ et sécrète une variété de facteurs de croissance et de facteurs essentiels pour maintenir l’intégrité structurelle de la rétine et de la choriocapillaris, soutenant ainsi la survie des photorécepteurs et fournissant une base pour la circulation et l’apport de nutriments.

Dans les yeux sains, le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) est responsable de l’équilibre des effets du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et protège les neurones contre l’apoptose, empêche la prolifération des cellules endothéliales et stabilise l’endothélium capillaire. Un rapport VEGF-/ PEDF décalé est lié à la néovascularisation oculaire, qui a été observée dans les modèles animaux^4,5 ainsi que dans des échantillons de patients atteints de néovascularisation choroïdienne (CNV) due à la DMLA et à la rétinopathie diabétique proliférante 6,7,8,9,10 . La concentration accrue de VEGF est la cible du traitement standard actuel. Les produits pharmaceutiques anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept et, plus récemment, brolucizumab améliorent l’acuité visuelle chez environ un tiers des patients atteints de CNV ou plutôt stabilisent la vision dans 90% des cas^11,12,13. Cependant, les injections intravitréennes fréquentes, souvent mensuelles, comportent un risque d’événements indésirables¹⁴, nuisent à l’observance du patient et représentent un fardeau économique important pour les systèmes de santé¹⁵. De plus, un certain pourcentage de patients (2%-20%) ne répondent pas ou ne réagissent que mal au traitement anti-VEGF^16,17,18,19. Ces concomitants négatifs nécessitent le développement de traitements alternatifs, par exemple, des implants intraoculaires, des approches thérapeutiques cellulaires et/ou géniques.

La thérapie génique a évolué en tant que traitement prometteur pour les maladies héréditaires et non héréditaires et vise à restaurer les séquences de gènes non fonctionnelles ou à supprimer celles qui ont mal fonctionné. Pour les maladies polygéniques, où l’identification et le remplacement des facteurs de causalité sont difficilement possibles, les stratégies visent l’administration continue d’un facteur de protection. Dans le cas de la DMLA, diverses thérapies additives ont été développées, telles que l’expression stable de l’endostatine et de l’angiostatine²⁰, l’antagoniste du VEGF soluble de la tyrosine kinase-1 (sFLT-1)21,22, le groupe de protéines régulatrices du complément de différenciation 59 (CD59)23 ou PEDF ^24,25 . L’œil, et en particulier la rétine, est une excellente cible pour un médicament à base de gènes en raison de sa structure fermée, de sa bonne accessibilité, de sa petite taille et de son privilège immunitaire, permettant ainsi une administration localisée de faibles doses thérapeutiques et rendant les greffes moins sensibles au rejet. De plus, l’œil permet une surveillance non invasive et la rétine peut être examinée par différentes techniques d’imagerie.

Les vecteurs viraux sont, en raison de leur grande efficacité de transduction, le principal véhicule pour délivrer des gènes thérapeutiques dans les cellules cibles. Cependant, selon le vecteur viral utilisé, différents effets indésirables ont été décrits, tels que les réponses immunitaires et inflammatoires²⁶, les effets mutagènes et oncogènes 27,28^, ou la dissémination dans d’autres tissus²⁹. Les limitations pratiques comprennent une taille d’emballage restreinte³⁰ ainsi que des difficultés et des coûts associés à la production de lots de qualité clinique^31,32. Ces inconvénients ont favorisé le développement de vecteurs plasmidiques non viraux qui sont transférés via des lipo / polyplexes, des ultrasons ou des électroporations. Cependant, l’intégration génomique du transgène dans le génome de l’hôte n’est généralement pas favorisée avec les vecteurs plasmidiques, ce qui entraîne une expression transitoire.

Les transposons sont des fragments d’ADN naturels qui changent de position dans le génome, une caractéristique qui a été adoptée pour la thérapie génique. Grâce à un mécanisme d’intégration actif, les systèmes vectoriels basés sur les transposons permettent une expression continue et constante du transgène inséré. Le transposon de la Belle au bois dormant (SB), reconstitué à partir d’un ancien transposon de type Tc1/marin trouvé chez les poissons³³ et encore amélioré par l’évolution moléculaire aboutissant à la variante hyperactive SB100X³⁴, a permis une transposition efficace dans diverses cellules primaires et a été utilisé pour la correction phénotypique dans différents modèles de maladie³⁵. À l’heure actuelle, 13 essais cliniques ont été lancés à l’aide du système de transposons SB . Le système de transposons SB100X se compose de deux composants: le transposon, qui comprend le gène d’intérêt flanqué de répétitions inversées terminales (TIR), et la transposase, qui mobilise le transposon. Après l’administration de l’ADN plasmidique aux cellules, la transposase lie les TIR et catalyse l’excision et l’intégration du transposon dans le génome de la cellule.

Nous avons développé une thérapie additive non virale à base de cellules pour le traitement de la DMLA néovasculaire. L’approche comprend l’insertion par électroporation du gène PEDF dans les cellules épithéliales pigmentaires primaires (PE) au moyen du système de transposons SB100X ^36,37,38. L’information génétique de la transposase et de la PEDF est fournie sur des plasmides séparés, permettant ainsi l’ajustement du rapport transposon SB100X / PEDF idéal. L’électroporation est réalisée à l’aide d’un système de transfection capillaire à pipette qui se caractérise par une taille d’espace maximisée entre les électrodes tout en minimisant leur surface. Il a été démontré que le dispositif atteignait d’excellents taux de transfection dans un large éventail de cellules de mammifères 39,40,41. La petite surface de l’électrode fournit un champ électrique uniforme et réduit les différents effets secondaires de l’électrolyse⁴².

La fonctionnalité anti-angiogénique de la PEDF sécrétée par les cellules épithéliales pigmentaires transfectées a été démontrée dans diverses expériences in vitro analysant la germination, la migration et l’apoptose des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine⁴³. De plus, la transplantation de cellules transfectées par PEDF dans un modèle de lapin de néovascularisation cornéenne⁴⁴ ainsi qu’un modèle de rat de CNV^43,45,46 ont montré un déclin de la néovascularisation.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’insertion stable du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires via le système de transposon SB100X en utilisant un système de transfection capillaire. Les cellules transfectées ont été conservées en culture pendant 21 jours, puis analysées en termes d’expression du gène PEDF par réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) et en termes de sécrétion de protéines PEDF par immunoblot et dosage immuno-enzymatique (ELISA, Figure 1).

Protocol

Les yeux de donneurs humains ont été obtenus auprès de la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle du Département d’ophtalmologie (Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) après avoir obtenu un consentement éclairé conformément aux protocoles de la Déclaration d’Helsinki. Les procédures de prélèvement et d’utilisation des échantillons humains ont été approuvées par le comité d’éthique de l’établissement. 1. Isolement des cellules EPR humaines primaires D…

Representative Results

Culture et électroporation de cellules EPR humaines primairesNous avons montré que l’ensemencement d’un nombre suffisant de cellules primaires EPR d’origine animale permet la culture et la croissance vers une monocouche intégrée de cellules pigmentées de forme hexagonale36,37,48. Leur capacité à former des jonctions serrées, à présenter une activité phagocyta…

Discussion

Dans notre projet, nous visons la production non virale de cellules EPR primaires humaines génétiquement modifiées qui surexpriment et sécrètent continuellement un facteur efficace afin d’utiliser les cellules transfectées comme thérapeutique à long terme pour l’établissement et le maintien d’un environnement protecteur. Nous avons établi l’introduction du gène codant pour la PEDF, une protéine multifonctionnelle omniprésente avec des fonctions anti-angiogéniques et neuroprotectrices. Le protocole d…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054