In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Summary

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF’s) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM’s), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM’s via calcium (^{Ca2 +}) flux mogelijk is.

Abstract

Hartherprogrammering is een potentieel veelbelovende therapie geworden om een beschadigd hart te herstellen. Door meerdere transcriptiefactoren te introduceren, waaronder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kunnen fibroblasten worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde cardiomyocyten (iCM’s). Deze iCM’s, wanneer ze in situ worden gegenereerd in een infarcthart, integreren elektrisch en mechanisch met het omringende myocardium, wat leidt tot een vermindering van de littekengrootte en een verbetering van de hartfunctie. Vanwege de relatief lage herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit van de iCM’s blijft de karakterisering van iCM’s een uitdaging. De momenteel gebruikte methoden op dit gebied, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR, richten zich voornamelijk op hartspecifieke gen- en eiwitexpressie, maar niet op de functionele rijping van iCM’s. Getriggerd door actiepotentialen, leidt het openen van spanningsafhankelijke calciumkanalen in cardiomyocyten tot een snelle instroom van calcium in de cel. Daarom is het kwantificeren van de snelheid van calciuminstroom een veelbelovende methode om de cardiomyocytenfunctie te evalueren. Hier introduceert het protocol een methode om de iCM-functie te evalueren door calcium (^{Ca2 +}) flux. Een αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam werd vastgesteld door Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (hierna Myh6-Cre genoemd) te kruisen met Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (hierna Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genoemd) muizen. Neonatale cardiale fibroblasten (NCF’s) van P0-P2 neonatale muizen werden geïsoleerd en in vitro gekweekt, en een polycistronische constructie van MGT werd geïntroduceerd bij NPF’s, wat leidde tot hun herprogrammering naar iCM’s. Omdat alleen succesvol geherprogrammeerde iCM’s de GCaMP3-reporter tot expressie brengen, kan de functionele rijping van iCM’s visueel worden beoordeeld door ^{Ca2 +} flux met fluorescentiemicroscopie. Vergeleken met niet-geherprogrammeerde NKK’s vertoonden NCF-iCM’s een significante calciumtransiënte flux en spontane contractie, vergelijkbaar met CM’s. Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van muizenstam, isolatie en selectie van neonatale muizenharten, NCF-isolatie, productie van retrovirus voor cardiale herprogrammering, iCM-inductie, de evaluatie van iCM ^{Ca2 +} flux met behulp van onze reporterlijn en gerelateerde statistische analyse en gegevenspresentatie. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden een waardevol platform zullen bieden om de functionele rijping van iCM’s voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen.

Introduction

Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een ernstige ziekte. Hart- en vaatziekten (CVD’s) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en zijn goed voor ongeveer 18,6 miljoen sterfgevallen in 20191,2. De totale sterfte van CVD’s is de afgelopen halve eeuw afgenomen. Deze trend is echter vertraagd of zelfs gekeerd in sommige onontwikkelde ^landen1, wat vraagt om effectievere behandelingen van HVZ. Als een van de fatale manifestaties van HVZ is MI goed voor ongeveer de helft van alle sterfgevallen die worden toegeschreven aan HVZ in de Verenigde ^Staten2. Tijdens de ischemie, met de blokkering van kransslagaders en beperkte toevoer van zowel voedingsstoffen als zuurstof, lijdt het myocardium aan ernstige metabole veranderingen, schaadt het de systolische functie van cardiomyocyten (CMs) en leidt het tot CM-dood3. Talrijke benaderingen in cardiovasculair onderzoek zijn onderzocht om hartletsel te herstellen en de functie van het gewonde hart te ^herstellen4. Directe hartherprogrammering is naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om het beschadigde hart te herstellen en de functie ervan te ^{herstellen5,6}. Door de introductie van Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kunnen fibroblasten in vitro en in vivo worden geherprogrammeerd naar iCM’s, en die iCM’s kunnen het littekengebied verminderen en de hartfunctie ^{verbeteren7,8}.

Hoewel hartherprogrammering een veelbelovende strategie is voor MI-behandeling, blijven er een aantal uitdagingen. Ten eerste zijn de herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit niet altijd zo hoog als verwacht. MGT-inducering kan slechts 8,4% (cTnT+) of 24,7% (αMHC-GFP+) van de totale CF’s bereiken die in vitro naar iCM’s moeten worden geherprogrammeerd7, of tot 35% in vivo8, wat de toepassing ervan beperkt. Zelfs met meer factoren geïnduceerd in het systeem, zoals ^Hand29 of Akt1 / ^PKB10, is de herprogrammeringsefficiëntie nog steeds nauwelijks bevredigend om in een klinische omgeving te worden gebruikt. Daarom zijn er meer studies nodig die gericht zijn op het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie op dit gebied. Ten tweede zijn de elektrische integriteit en contractiekenmerken van iCM’s belangrijk voor de efficiënte verbetering van de hartfunctie, maar deze zijn een uitdaging om te evalueren. Momenteel zijn veelgebruikte evaluatiemethoden in het veld, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR van enkele belangrijke CMs-genenexpressie, allemaal gericht op de gelijkenis van iCM’s en CMs, maar niet direct gerelateerd aan de functionele kenmerken van iCM’s. Bovendien hebben die methoden relatief ingewikkelde procedures en zijn ze tijdrovend. Terwijl herprogrammeringsstudies meestal een screening van potentiële herprogrammeringsfactoren omvatten die de rijping van iCM’s ^bevorderen11, vereist cardiale herprogrammering een snelle en handige methode op basis van de iCM-functie.

CMs openen de spanningsafhankelijke calciumionkanalen op het cytomembraan tijdens elke contracteringscyclus, wat leidt tot een voorbijgaande instroom van calciumion (^{Ca2 +}) van de intercellulaire vloeistof naar het cytoplasma om deel te nemen aan de myofilamentcontractie. Zo’n ^Ca2+ instroom- en outfluxcyclus is de fundamentele eigenschap van myocardiale contractie en vormt de normale functie van ^CMs12. Een methode die ^Ca2+ instroom detecteert, zou dus een mogelijke manier kunnen zijn om de functie van CM’s en CM-achtige cellen, waaronder iCM’s, te meten. Bovendien biedt een dergelijke methode voor iCM’s een andere manier om de efficiëntie van herprogrammering te evalueren.

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s) zijn ontwikkeld en op grote schaal gebruikt om celactiviteiten aan te geven, met name actiepotentialen. Over het algemeen bestaan GECI’s uit een ^{Ca2 +} bindend domein zoals calmodulin en een fluorescerend domein zoals GFP, en GCaMP3 is er een met een hoge affiniteit en fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedomein van GCaMP3 wordt geactiveerd wanneer de lokale calciumconcentratie wordt ^gewijzigd13. In dit artikel wordt een muizenstam beschreven die specifiek een GCaMP3-verslaggever in Myh6+ cellen tot expressie brengt. Door MGT te introduceren in de geïsoleerde NCF’s van pasgeborenen van deze stam, kan de herprogrammering worden gevolgd door fluorescentie, die met succes geherprogrammeerde iCM’s zal vertonen. Zo’n muizenstam en -methode zal een waardevol platform bieden om cardiale herprogrammering te onderzoeken.

Protocol

Alle experimentele procedures en praktijken met dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care & Use Committee van de Universiteit van Michigan. Alle experimentele procedures en praktijken met celkweek moeten worden uitgevoerd BSL2 Biologische Veiligheidskast onder steriele omstandigheden. Voor de procedures en praktijken met betrekking tot virussen werd de richtlijn van de juiste verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buizen gevolgd om het risico van milieu- en gezondheidsrisico’s te voor…

Representative Results

De experimentele workflow voor het genereren van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam en de genstructuur van de transgene muizen is weergegeven in figuur 1. Terwijl de muizenstam is vastgesteld, werden de harten van de pups geïsoleerd en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om het genotype te bevestigen. Harten met correct genotype tonen Ca2+ flux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3 fluorescentie, terwijl er geen fluorescentie …

Discussion

Het evalueren van de iCM-functie is noodzakelijk voor het cardiale herprogrammeringsveld. In dit manuscript beschrijft het protocol een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J muizenstam die is vastgesteld, hoe de NPF’s geïsoleerd uit de neonatale muizen in deze stam te gebruiken voor de herprogrammering naar iCM’s, en de evaluatie van de iCM-functie door ^Ca2+ flux. Dit is een de novo methode om de functionele rijping van iCM’s te evalueren.

Versc…

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365