GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가
Summary
우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.
Abstract
심장 재프로그래밍은 손상된 심장을 복구하는 잠재적으로 유망한 치료법이되었습니다. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT)를 포함하여 다중 전사 요인을 도입함으로써 섬유아세포는 유도된 심근세포(iCM)로 다시 프로그래밍될 수 있습니다. 이러한 iCM은 극한의 심장에서 시투에서 생성될 때 주변 심근과 전기및 기계적으로 통합되어 흉터 크기가 감소하고 심장 기능이 개선됩니다. IMC의 리프로그래밍 효율성, 순도 및 품질이 상대적으로 낮기 때문에 iMC의 특성화는 여전히 어려운 과제입니다. 현재 사용되는 방법은 유동 세포측정, 면역 세포화학 및 qPCR을 포함하여 주로 심장 특이적 유전자 및 단백질 발현에 초점을 맞추고 있지만 iCM의 기능성 성숙에는 초점을 맞추지 않습니다. 작용 잠재력에 의해 촉발, 심근 세포에 전압 게이트 칼슘 채널의 개방은 세포로 칼슘의 급속한 유입으로 이어질. 따라서 칼슘 유입 속도를 정량화하는 것은 심근세포 기능을 평가하는 유망한 방법입니다. 여기서, 프로토콜은 칼슘(Ca2+) 플럭스로 iCM 기능을 평가하는 방법을 소개한다. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-GCaMP3 마우스 스트레인은 Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)의 Hze/J(Rosa26A-M-Stop-M3-M)와 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J(아래 Myh6-Cre라고 함)를 교차하여 설립되었습니다. P0-P2 신생아 마우스의 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 시험관 내에서 분리되고 배양되었고, MGT의 다각성 건설은 NCFs에 도입되어 ICM에 대한 리프로그래밍을 주도하였다. 성공적으로 다시 프로그래밍된 iMC만이 GCaMP3 리포터를 발현하기 때문에 iCM의 기능성숙은 형광 현미경 으로 Ca2+ 플럭스로 시각적으로 평가될 수 있습니다. NCF-iC는 비프로그래밍된 NCF와 비교하여 CM과 유사한 상당한 칼슘 과도 플럭스와 자발적인 수축을 보였습니다. 이 프로토콜은 마우스 변형 소작용 확립, 분리 및 신생아 마우스 심장의 선택, NCF 절연, 심장 재프로그래밍을 위한 레트로바이러스 생성, iCM 유도, 기자 라인을 이용한 iCM Ca2+ 플럭스의 평가, 관련 통계 분석 및 데이터 프레젠테이션을 자세히 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 심장 재프로그래밍 연구를 위한 iCM의 기능성숙을 평가하는 귀중한 플랫폼을 제공할 것으로 기대된다.
Introduction
심근 경색 (MI)은 전 세계적으로 심각한 질병입니다. 심장 혈관 질병 (CVDs)는 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며 20191,2에서 약 1,860 만 명의 사망자를 차지합니다. CVD의 총 사망률은 지난 반세기 동안 감소했습니다. 그러나, 이러한 경향은 CVDs의 더 효과적인 처리를 요구하는 몇몇 미개발 국가에서 둔화되거나 반전되었습니다1. CVD의 치명적인 표현의 한개, MI는 미국에 있는 CVDs에 기인한 모든 죽음의 대략 반을 차지합니다2. 허혈 동안 관상 동맥의 차단과 영양소와 산소의 공급이 제한되어 심근은 심한 대사 변화를 겪고 심근 세포 (CM)의 수축기 기능을 손상시키고 CM 사망3로 이어집니다. 심장 혈관 연구에 있는 수많은 접근은 심장 상해를 복구하고 부상당한 심장4의 기능을 복구하기 위하여 탐구되었습니다. 직접적인 심장 리프로그래밍은 손상된 심장을 복구하고 기능을 복원하는 하나의 유망한 전략으로 부상했습니다5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT)를 도입함으로써 섬유아세포는 체외 및 생체 내 iMC로 다시 프로그래밍할 수 있으며, 이러한 iCM은 흉터 부위를 줄이고 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다7,8.
심장 재프로그래밍은 MI 처리를 위한 유망한 전략이지만, 많은 도전이 남아 있습니다. 첫째, 리프로그래밍 효율, 순도 및 품질이 항상 예상만큼 높지는 않습니다. MGT 유도는 시험관7에서 iCM으로 다시 프로그래밍될 총 CF의 8.4%(cTnT+) 또는 24.7%(αMHC-GFP+)만 달성할 수 있으며, 이는 해당 애플리케이션을 제한하는 생체 내에서 최대 35%까지 달성할 수 있다. Hand29 또는 Akt1/PKB10과 같은 시스템에 더 많은 요인이 유도되어 있더라도, 재프로그래밍 효율은 여전히 임상 환경에서 사용될 수 있는 거의 만족스럽지 않다. 따라서 이 분야에서는 리프로그래밍 효율성 향상에 초점을 맞춘 연구가 더 많이 필요합니다. 둘째, IMC의 전기 적 무결성 및 수축 특성은 심장 기능의 효율적인 개선을 위해 중요하지만, 이들은 평가하기 어렵다. 현재, 일부 주요 CM 유전자 발현의 유혈 세포측정, 면역세포화학 및 qPCR을 포함한 분야에서 널리 사용되는 평가 방법은 모두 iCM 및 CM의 유사성에 초점을 맞추고 있지만 iMC의 기능적 특성과 직접적인 관련이 없다. 또한 이러한 방법은 비교적 복잡한 절차를 가지며 시간이 많이 걸립니다. 재프로그래밍 연구는 일반적으로 iCM 성숙을 촉진하는 잠재적인 재프로그래밍 요인의 검사를 포함하지만, 심장 재프로그래밍은 iMC 기능에 따라 빠르고 편리한 방법을 요구합니다.
CM은 각 계약 주기 동안 사이토멤브레인에 전압 게이트 칼슘 이온 채널을 열어 세포간 유체에서 세포질로칼슘 이온(Ca2+)의 일시적인 유입으로 이어져 근막 수축에 참여합니다. 이러한 Ca2+ 유입 및 외동성 주기는 심근 수축의 기본 특성이며 CMs12의 정상적인 기능을 구성합니다. 따라서 Ca2+ 유입을 감지하는 방법은 IMC를 포함한 CM 및 CM과 같은 세포의 기능을 측정하는 잠재적인 방법이 될 수 있습니다. 또한 iMC의 경우 이러한 방법은 재프로그래밍 효율성을 평가하는 또 다른 방법을 제공합니다.
유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표 (GECIs)는 세포 활동, 특히 행동 잠재력을 나타내는 데 널리 사용되었습니다. 일반적으로 GECI는 칼모둘린과 같은 Ca2+ 결합 도메인으로 구성되며, GFP와 같은 형광 도메인및 GCaMP3는 높은 친화력 및 형광 강도를 가진 도메인이다. GCaMP3의 형광 도메인은 국소 칼슘 농도가 변경될 때 활성화됩니다13. 본 논문에서, Myh6+ 세포에서 GCaMP3 리포터를 구체적으로 표현하는 마우스 변형이 설명된다. 이 균주의 신생아로부터 고립된 NCF에 MGT를 도입함으로써, 재프로그래밍은 형광에 의해 모니터링될 수 있으며, 이는 성공적으로 iMC를 다시 프로그래밍할 것이다. 이러한 마우스 변형 및 방법은 심장 재프로그래밍을 조사하는 귀중한 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심장 리프로그래밍 필드에iC 함수를 평가하는 것이 필요합니다. 이 원고에서, 프로토콜은 Tg (Myh6-cre)1Jmk / J / Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Ze / J 마우스 변형을 설명하고, iCM에 대한 재프로그래밍을 위한 이 균주에서 신생아 마우스로부터 분리된 NCF를 사용하는 방법, 그리고 iC의 iC 함수에 의한 iC의 평가를 설명한다. 이것은 iCM 기능 성숙을 평가하는 de novo 방법입니다.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 원고의 영어 텍스트를 편집레오 Gnatovskiy의 노력을 주셔서 감사합니다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 이 연구는 미국의 국립 보건 원 (NIH)에 의해 지원되었다 (1R01HL109054) 왕 박사에 보조금.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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