GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価
Summary
ここでは、Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J(以下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)の確立と適用について述べています。マウス株から分離された新生児心臓線維芽細胞(NCF)は、誘導心筋細胞(iCM)に変換され、カルシウム(Ca2+)フラックスを介したiCMのリプログラミング効率と機能的成熟の便利かつ効率的な評価を可能にします。
Abstract
心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復するための潜在的に有望な治療法となっています。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を含む複数の転写因子を導入することにより、線維芽細胞を誘導心筋細胞(iCM)に再プログラムすることができる。これらのiCMは、梗塞した心臓 の中でその場で 発生した場合、電気的および機械的に周囲の心筋と統合し、瘢痕サイズの縮小および心臓機能の改善を招く。iCM のリプログラミング効率、純度、品質が比較的低いため、iCM の特性評価は依然として課題となっています。フローサイトメトリー、免疫細胞化学、qPCRなど、現在使用されている方法は、主に心臓特異的遺伝子とタンパク質発現に焦点を当てていますが、iCMの機能的成熟には焦点を当てていない。行動電位によって引き起こされ、心筋細胞における電圧ゲートカルシウムチャネルの開放は、細胞内にカルシウムの急速な流入をもたらす。従って、カルシウム流入率を定量化することは、心筋細胞機能を評価する有望な方法である。ここで、プロトコルはカルシウム(Ca2+)フラックスによるiCM機能を評価する方法を導入する。αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株は、Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hz/J(ローザ26A-Flox-Stop-C-G3マウス)とTg(Myh6-cre)1Jmk/J(以下のMyh6-Creと呼ばれる)を交合することによって確立されました。P0-P2新生児マウスからの新生児心臓線維芽細胞(NcF)を インビトロで単離して培養し、MGTの多元性構造をNCFに導入し、iCMへの再プログラミングにつながった。正常に再プログラムされたiCMだけがGCaMP3レポーターを発現するので、iCMの機能的成熟は蛍光顕微鏡でCa2+ フラックスによって視覚的に評価することができる。NCF-iCMは、再プログラムされていないNFと比較して、CMと同様に有意なカルシウム過渡束および自発的収縮を示した。このプロトコルは、マウス株の確立、新生児マウス心臓の単離および選択、NCF単離、心臓リプログラミング用レトロウイルスの産生、iCM誘導、レポーターラインを用いたiCM Ca2+ フラックスの評価、および関連する統計分析およびデータ提示について詳細に説明する。ここで説明する方法は、心臓リプログラミング研究のためのiCMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供することが期待される。
Introduction
心筋梗塞(MI)は世界的に重篤な疾患です。心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因であり、20191年には約1,860万人が死亡しました。過去半世紀の間にCVDの総死亡率は減少した。しかし、この傾向は、CVDのより効果的な治療法を求める一部の未開発国1では減速または逆転しています。CVDの致命的な症状の1つとして、MIは米国のCVDに起因するすべての死亡の約半分を占めています2。虚血の間、冠状動脈の遮断および栄養素および酸素の両方の供給が限られていると、心筋は重度の代謝変化に苦しみ、心筋細胞(CM)の収縮期機能を損ない、CM死3に至る。心血管研究における多数のアプローチは、心臓損傷を修復し、負傷した心臓の機能を回復するために探求されてきた4.直接心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復し、その機能を回復するための1つの有望な戦略として浮上しています5,6。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を導入することにより、線維芽細胞をインビトロおよびインビボでiCMに再プログラムすることができ、それらのiCMは瘢痕領域を減少させ、心臓機能を改善することができる7,8。
心臓リプログラミングはMI治療の有望な戦略ですが、多くの課題が残っています。第1に、リプログラミング効率、純度、品質が期待したほど高いとは限りません。MGT誘導は、vitro7でiCMに再プログラムされる全CFの8.4%(cTnT+)または24.7%(αMHC-GFP+)、またはvivo8で最大35%しか達成できないため、その用途は制限されています。Hand29 や Akt1/PKB10 など、システム内で誘導される因子が多くても、リプログラミング効率は臨床現場で使用されるのにほとんど満足できません。したがって、この分野では、リプログラミング効率の向上に焦点を当てたより多くの研究が必要とされている。第二に、iCMの電気的完全性と収縮特性は、心臓機能の効率的な改善のために重要であるが、これらは評価に挑戦している。現在、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、およびいくつかの主要なCM遺伝子発現のqPCRを含むこの分野で広く使用されている評価方法は、すべてiCMとCMの類似性に焦点を当てていますが、iCMの機能的特性に直接関係していません。さらに、これらの方法は比較的複雑な手順を有し、時間がかかる。リプログラミング研究は通常、iCM成熟11を促進する潜在的なリプログラミング因子のスクリーニングを伴うが、心臓リプログラミングはiCM機能に基づく迅速かつ便利な方法を求める。
CMは、収縮周期の間に細胞膜上の電圧ゲートカルシウムイオンチャネルを開き、細胞間流体から細胞質へのカルシウムイオン(Ca2+)の一過性流入を招き、筋形筋収縮に関与します。このようなCa2+ 流入および流出サイクルは心筋収縮の基本的な特徴であり、CMs12の正常な機能を構成する。したがって、Ca2+ 流入を検出する方法は、CMやCM様細胞(iCMを含む)の機能を測定する潜在的な方法となり得る。さらに、iCMの場合、このような方法は、再プログラミング効率を評価する別の方法を提供する。
遺伝子組み換えカルシウム指標(GECI)は、細胞活動、特に作用電位を示すために開発され、広く使用されています。一般に、GECはカルモジュリンなどのCa2+ 結合ドメインとGFPなどの蛍光ドメインで構成され、GCaMP3は高い親和性と蛍光強度を有するドメインです。GCaMP3の蛍光ドメインは、局所的なカルシウム濃度が変化したときに活性化される13。本論文では、Myh6+細胞においてGCaMP3レポーターを特異的に発現するマウス株について説明する。この株の新生児から分離されたNcFにMGTを導入することにより、リプログラミングは蛍光によって監視することができ、これは正常に再プログラムされたiCMが発揮されます。このようなマウス株および方法は、心臓リプログラミングを調査するための貴重なプラットフォームを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
iCM機能の評価は、心臓リプログラミング分野で必要です。本稿では、プロトコルは、確立されたTg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株、この株の新生児マウスから分離されたNDFを使用してiCmに再プログラミングする方法、およびCa2+ フラックスによるiCMs関数の評価について説明しています。これは、iCM機能成熟を評価する デノボ 法である。
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の英語のテキストを編集するレオ・グナトフスキーの努力に感謝します。図 1 は、BioRender.com で作成されています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)によって支援されました (1R01HL109054) 王博士への助成金.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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