طريقة فعالة لتوجيه الخلايا الكبدية مثل التعريفي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).
Abstract
الوظائف المحتملة للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLCs) المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تبشر بالكثير لنمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية. 10- إن هذه الطريقة هي طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتمايز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى مركبات سداسية الهكربون الوظيفية. ويعتبر إنشاء سلالة من الاندوديرم خطوة رئيسية في التمايز بين المراكز العليا. من خلال طريقتنا، ونحن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية من خلال استكمال مستمر أكتيفين A وCHIR99021 خلال التمايز hESC إلى endoderm نهائي (DE)، تليها جيل من خلايا السلف الكبدي، وأخيرا HLCs مع مورفولوجيا خلايا الكبد نموذجية في طريقة حكمية مع الكواشف محددة تماما. وHESC المشتقة من HLCs التي تنتجها هذه الطريقة التعبير عن علامات مرحلة محددة (بما في ذلك الألبومين، مستقبلات HNF4α النووية، وتوروشولات الصوديوم cotransporting polypeptide (NTCP))، وتظهر خصائص خاصة تتعلق خلايا الكبد ناضجة والوظيفية (بما في ذلك تلطيخ الأخضر إيندوكيانين، تخزين الجليكوجين، تلطيخ hematoxylin-eosin والنشاط CYP3)، ويمكن أن توفر منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC في دراسة أمراض الكبد.
Introduction
الكبد هو جهاز الأيضية للغاية التي تلعب عدة أدوار, بما في ذلك السمية, تخزين الجليكوجين, وإفراز وتوليف البروتينات1. مسببات الأمراض المختلفة والأدوية والوراثة يمكن أن يسبب تغيرات مرضية في الكبد وتؤثر على وظائفه2،3. تلعب خلايا الكبد ، باعتبارها الوحدة الوظيفية الرئيسية للكبد ، دورا مهما في أنظمة دعم الكبد الاصطناعي والقضاء على سمية الدواء. ومع ذلك ، فإن مورد خلايا الكبد البشرية الأولية محدود في العلاج القائم على الخلايا ، وكذلك في أبحاث أمراض الكبد. لذلك ، فإن تطوير مصادر جديدة للخلايا الكبدية البشرية الوظيفية هو اتجاه بحثي مهم في مجال الطب التجديدي. منذ عام 1998 عندما تم إنشاء hESCs4، وقد تم النظر على نطاق واسع hESCs من قبل الباحثين بسبب إمكاناتها التمايز متفوقة (أنها يمكن أن تفرق في أنسجة مختلفة في بيئة مناسبة) ودرجة عالية من التجديد الذاتي، وبالتالي توفير خلايا المصدر المثالي للكبد الاصطناعي الحيوي، وزرع خلايا الكبد وحتىهندسة أنسجةالكبد 5 .
حاليا، يمكن زيادة كفاءة التمايز الكبدي بشكل كبير من خلال إثراء اندوديرم6. في تمايز النسب من الخلايا الجذعية إلى بطانة الرحم، ومستويات عامل النمو تحويل β (TGF-β) الإشارات ومسارات الإشارات WNT هي العوامل الرئيسية في عقدة مرحلة تشكيل بطانة الرحم. تفعيل مستوى عال من TGF-β وWNT الإشارات يمكن أن تعزز تطوير endoderm7,8. أكتيفين A هو السيتوكين تنتمي إلى عائلة فائقة TGF-β. لذلك ، يستخدم Activin A على نطاق واسع في تحريض الإندوديرم للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) وhESCs9،10. GSK3 هو بروتين سيرين ثريونين كيناز. وقد وجد الباحثون أن CHIR99021، مثبط محدد من GSK3β، يمكن أن تحفز إشارات WNT نموذجية، ويمكن أن تعزز تمايز الخلايا الجذعية في ظل ظروف معينة، مما يشير إلى أن CHIR99021 لديه القدرة على تحفيز تمايز الخلايا الجذعية في endoderm 11،12،13.
هنا نبلغ عن طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز التمايز الفعال للمركبات الهيدروفلورية إلى مركبات إتش إل سي وظيفية. أنتجت الإضافة المتتابعة ل Activin A و CHIR99021 حوالي 89.7±0.8٪ SOX17 (DE marker) خلايا إيجابية. بعد أن نضجت هذه الخلايا في المختبر، عبرت عن علامات محددة كبدية ومارست مورفولوجيا تشبه الخلايا الكبدية (استنادا إلى تلطيخ الهيماتوكسيلين -إيوزين (H و E)) ووظائف ، مثل امتصاص الأخضر الإندوسيانين (ICG) وتخزين الجليكوجين ونشاط CYP3. وتبين النتائج أن hESCs يمكن تمييزها بنجاح إلى HLCs وظيفية ناضجة بهذه الطريقة ويمكن أن توفر أساسا للبحوث المتعلقة بأمراض الكبد وفحص الأدوية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم طريقة تدريجية تحفز HLCs من hESCs على ثلاث مراحل. وفي المرحلة الأولى، استخدمت أكتيفين ألف وCHIR99021 لتمييز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى DE. وفي المرحلة الثانية، استخدمت الخلايا السلفية KO-DMEM وDMSO لتمييز DE إلى خلايا سلف كبدية. وفي المرحلة الثالثة، استخدمت HZM بالإضافة إلى HGF وOSM وهيدروكورت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81870432 81570567 إلى شركة X.L.Z. (رقم 81571994 إلى شركة P.N.S.)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة غوانغدونغ، الصين (رقم 2020A1515010054 إلى P.N.S.)، مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. 发育生物学. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
