Summary

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Published: May 06, 2021
doi:

Summary

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC’s) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC’s) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Abstract

De potentiële functies van hepatocyt-achtige cellen (HLC’s) afkomstig van menselijke embryonale stamcellen (hESC’s) zijn veelbelovend voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreeningtoepassingen. Hier wordt een efficiënte en reproduceerbare methode voor differentiatie van hESC’s in functionele HCC’s gegeven. De oprichting van een endoderm-afstamming is een belangrijke stap in de differentiatie naar HCC’s. Met onze methode reguleren we de belangrijkste signaleringsroutes door continu Activin A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE), gevolgd door het genereren van hepatische voorlopercellen, en ten slotte HCC’s met typische hepatocytmorfologie in een stapsgewijze methode met volledig gedefinieerde reagentia. De hESC-afgeleide HCC’s die door deze methode worden geproduceerd, drukken stadiumspecifieke markers uit (waaronder albumine, HNF4α nucleaire receptor en natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide (NTCP)), en vertonen speciale kenmerken met betrekking tot volwassen en functionele hepatocyten (waaronder indocyaninegroene kleuring, glycogeenopslag, hematoxyline-eosinekleuring en CYP3-activiteit), en kunnen een platform bieden voor de ontwikkeling van HLC-gebaseerde toepassingen in de studie van leverziekten.

Introduction

De lever is een zeer metabolisch orgaan dat verschillende rollen speelt, waaronder deoxidatie, opslag van glycogeen en afscheiding en synthese van eiwitten1. Verschillende pathogenen, geneesmiddelen en ertstrouw kunnen pathologische veranderingen in de lever veroorzaken en de functies ervan beïnvloeden2,3. Hepatocyten, als de belangrijkste functionele eenheid van de lever, spelen een belangrijke rol in kunstmatige leverondersteunende systemen en eliminatie van geneesmiddelentoxiciteit. De bron van primaire menselijke hepatocyten is echter beperkt in celgebaseerde therapie, evenals in onderzoek naar leverziekten. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe bronnen van functionele menselijke hepatocyten een belangrijke onderzoeksrichting op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Sinds 1998, toen hESC’s4werden vastgesteld, zijn hESC’s door onderzoekers op grote schaal overwogen vanwege hun superieure differentiatiepotentieel (ze kunnen differentiëren in verschillende weefsels in een geschikte omgeving) en hoge mate van zelfvernieuwbaarheid, en bieden zo ideale broncellen voor bioartificiële levers, hepatocyttransplantatie en zelfs leverweefseltechnologie5.

Momenteel kan de efficiëntie van de leverdifferentiatie sterk worden verhoogd door het endoderm te verrijken6. In de afstammingsdifferentiatie van stamcellen in endoderm zijn niveaus van de transformerende groeifactor β (TGF-β) signalerings- en WNT-signaleringsroutes de belangrijkste factoren in de knoop van de endodermvormingsfase. Activering van een hoog niveau van TGF-β en WNT-signalering kan de ontwikkeling van endoderm7,8bevorderen . Activine A is een cytokine behorend tot de TGF-β superfamilie. Daarom wordt Activine A veel gebruikt bij endoderm inductie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) en hESC’s9,10. GSK3 is een serine-threonine eiwitkinase. Onderzoekers hebben ontdekt dat CHIR99021, een specifieke remmer van GSK3β, typische WNT-signalen kan stimuleren en stamceldifferentiatie onder bepaalde omstandigheden kan bevorderen, wat suggereert dat CHIR99021 potentieel heeft voor het induceren van stamceldifferentiatie in endoderm 11,12,13.

Hier rapporteren we een efficiënte en reproduceerbare methode om de differentiatie van hESC’s in functionele HCC’s effectief te induceren. De sequentiële toevoeging van Activin A en CHIR99021 produceerde ongeveer 89,7±0,8% SOX17 (DE marker)-positieve cellen. Na verder gerijpt te zijn in vitro, drukten deze cellen leverspecifieke markers uit en oefenden hepatocyt-achtige morfologie uit (gebaseerd op hematoxyline-eosinekleuring (H & E)) en functies, zoals opname van indocyaninegroen (ICG), glycogeenopslag en CYP3-activiteit. De resultaten tonen aan dat hESC’s met succes kunnen worden gedifferentieerd in volwassen functionele HLC’s door deze methode en een basis kunnen vormen voor leverziektegerelateerd onderzoek en in vitro geneesmiddelenscreening.

Protocol

1. Stamcelonderhoud OPMERKING: Het hieronder beschreven celonderhoudsprotocol is van toepassing op de hES03-cellijn die in een aanhangend monolaag wordt onderhouden. Voor alle volgende protocollen in dit manuscript moeten cellen worden behandeld onder een biologische veiligheidskast. Bereid 1x mTesR stamcelkweekmedium voor door 5x aanvullend medium te verdunnen tot mTesR basismedium. Bereid 30x hESC-gekwalificeerd Matrigel medium voor door 5 ml hESC-gekwalificeerde Matrigel…

Representative Results

Het schematische diagram van HLC-inductie van hESC ‘s en representatieve bright-field beelden van elke differentiatiefase zijn weergegeven in figuur 1. In fase I werden Activine A en CHIR99021 gedurende 3 dagen toegevoegd om stamcellen te induceren om endodermcellen te vormen. In fase II differentieerden de endodermcellen zich in hepatische voorlopercellen nadat ze gedurende 5 dagen met differentiatiemedium waren behandeld. In stadium III waren vroege hepatocyten gerijpt en gedifferentieerd …

Discussion

Hier presenteren we een stapsgewijze methode die HCC’s uit hESC’s in drie fasen induceert. In de eerste fase werden Activin A en CHIR99021 gebruikt om hESC’s te differentiëren in DE. In de tweede fase werden KO-DMEM en DMSO gebruikt om DE te differentiëren in hepatische voorlopercellen. In de derde fase werden HZM plus HGF, OSM en hydrocortison 21-hemisuccinaatnatriumzout gebruikt om leverfappende voorlopercellen te blijven differentiëren in HCC’s.

Bij het gebruik van het protocol moet reke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. 81870432 and 81570567 to X.L.Z.), (No. 81571994 to P.N.S.); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2020A1515010054 aan P.N.S.), de Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). We willen prof. Stanley Lin van shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

References

  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. 发育生物学. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

View Video