인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법
Summary
이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESC)에서 파생 된 간세포와 같은 세포 (HLC)의 잠재적 인 기능은 질병 모델링 및 약물 선별 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 여기에 제공 기능 용 HLC로 hESC의 분화를위한 효율적이고 재현 가능한 방법이 있습니다. 엔도름 혈통의 확립은 HLC와 차별화의 핵심 단계입니다. 우리의 방법에 의해, 우리는 지속적으로 최종 엔도담 (DE)로 hESC 분화 하는 동안 Activin A와 CHIR99021을 보충 하 여 주요 신호 경로를 조절 하 고, 간 선조 세포의 생성 에 이어, 그리고 마지막으로 완전히 정의 된 시약을 가진 단계 별 방법으로 전형적인 간세포 형태와 HLCs. 이 방법에 의해 생성된 hESC 유래 HLC는 단계별 마커(알부민 포함) 및 HNF4α 핵수용체 및 타우로콜레이트 응수송 폴리펩티드(NTCP)는 성숙하고 기능적인 간세포(인도시아닌 그린 염색, 글리코겐 저장, 헤마톡시린-에신 염색 및 CYP3 활성 포함)와 관련된 특별한 특성을 나타내며, HLC 기반의 응용 분야의 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.
Introduction
간은 탈산화, 글리코겐 저장, 단백질1의분비 및 합성을 포함하여 여러 가지 역할을 하는 매우 신진 대사 기관이다. 각종 병원균, 약물 및 항종은 간에서 병리학적 변화를 일으킬 수 있으며 그 기능에 영향을 미칠 수있습니다2,3. 간장의 주요 기능 단위인 간세포는 인공 간 지원 시스템 및 약물 독성 제거에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 1 차적인 인간 간세포의 자원은 간 질병 연구에서 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 치료에서 제한됩니다. 따라서 기능성 인간 간세포의 새로운 소스를 개발하는 것은 재생 의학 분야에서 중요한 연구 방향입니다. 1998년 hESC가 설립된 이래4년이래, hESC는 우수한 분화 잠재력(적절한 환경에서 다양한 조직으로 분화할 수 있음) 및 높은 수준의 자기 갱신성 으로 인해 연구자들이 널리 고려해 왔으며, 따라서 생체인공간, 간세포 이식, 심지어 간 조직 공학5에이상적인 공급세포를 제공한다.
현재, 간 분화 효율은 엔도름6을농축함으로써 크게 증가할 수 있다. 줄기 세포의 혈통 분화에서 엔데담으로, β 변형 성장 인자 (TGF-β) 신호 및 WNT 신호 경로의 수준은 엔도름 형성 단계의 노드의 핵심 요소입니다. 높은 수준의 TGF-β 및 WNT 시그널링의 활성화는 엔도름7,8의개발을 촉진할 수 있다. 액티빈 A는 TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 사이토카인입니다. 따라서, 액티빈 A는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC) 및 hESC9,10의엔도름유도에널리 사용된다. GSK3는 세린-토닌 단백질 키나아제입니다. 연구원은 CHIR99021, GSK3β의 특정 억제제, 전형적인 WNT 신호를 자극할 수 있고, 특정 조건하에서 줄기 세포 분화를 촉진할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다, CHIR99021는 endoderm 11,12,13로줄기 세포 분화를 유도하기위한 잠재력을 가지고 있음을 시사.
여기서 는 hESC를 기능형 HLC로 효과적으로 차별화하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 액티빈 A와 CHIR99021의 순차적 첨가는 약 89.7±0.8% SOX17(DE 마커)-양성 세포를 생산하였다. 시험관에서추가 로 소화 된 후, 이들 세포는 간 특이적 마커를 발현하고 간세포와 같은 형태 (헤마톡시린 -eosin 염색 (H & E)에 기초하여) 및 기능, 인도시아닌 녹색 (ICG), 글리코겐 저장 및 CYP3 활성등의 섭취와 같은 기능. 결과는 hESC가 이 방법에 의해 성숙한 기능적인 HLC로 성공적으로 분화될 수 있고 간 질병 관련 연구 및 체외약 검열을 위한 기초를 제공할 수 있다는 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 hESC에서 HLC를 3단계로 유도하는 단계적 방법을 제시합니다. 첫 번째 단계에서액티빈 A와 CHIR99021은 hESC를 DE로 차별화하는 데 사용되었습니다. 두 번째 단계에서, KO-DMEM 및 DMSO는 간 선조 세포로 DE를 분화하기 위하여 이용되었습니다. 제 3 단계에서, HZM 플러스 HGF, OSM 및 하이드로 코르티손 21-hemisuccinate 나트륨 소금은 HLC로 간 선조 세포를 계속 분화하는 데 사용되었다.
?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(X.L.Z.에 81870432 및 81570567)에 의해 지원되었다(81571994 P.N.S.; 중국 광동성 자연과학재단(2020A1515010054호P.N.S.), 리카싱산투대학 재단(No. L1111 2008 – P.N.S.). 샨투 대학 의과 대학의 스탠리 린 교수에게 유용한 조언을 구해 주셔서 감사합니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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