Summary

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

Published: May 06, 2021
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Summary

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。

Abstract

ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の肝細胞様細胞(HLC)の潜在的な機能は、疾患のモデル化および薬物スクリーニング用途に大きな約束を果たしています。ここでは、機能性 Hfc に hESC を分化するための効率的で再現可能な方法を提供します。内胚葉系統の確立は、HLFc との差別化の重要なステップです。我々の方法により、hESC分化中のアクチビンAおよびCHIR99021を確実な内因(DE)に連続的に補い、続いて肝前駆細胞の生成、そして最後に完全に定義された試薬を用いた段階的な方法で典型的な肝細胞形態を有するHLCを補うことによって、主要なシグナル伝達経路を調節する。この方法によって生成されるhESC由来のHFCは、ステージ固有のマーカー(アルブミンを含む) HNF4α核受容体、及びタウロコール酸共輸送ポリペプチド(NTCP)と、成熟および機能的肝細胞(中毒性の緑染色、グリコーゲン保存、ヘマトキシリン-エオシン染色およびCYP3活性を含む)に関する特別な特徴を示し、肝疾患の研究におけるHLCベースの応用の開発のためのプラットフォームを提供することができる。

Introduction

肝臓は、脱酸化、グリコーゲンの貯蔵、タンパク質の分泌と合成など、いくつかの役割を果たす高度に代謝性の高い器官である1。様々な病原体、薬物および遺伝は肝臓の病理学的変化を引き起こし、その機能に影響を及ぼす2,3.肝細胞は、肝臓の主要な機能単位として、人工肝支援システムおよび薬物毒性除去において重要な役割を果たす。しかし、原発性ヒト肝細胞の資源は、細胞ベースの治療だけでなく、肝臓病の研究において限られている。したがって、ヒト肝細胞の機能性を新たに開発することは、再生医療分野における重要な研究の方向性である。hESCが確立された1998年から、hESCは優れた分化能力(適切な環境で様々な組織に分化することができる)と高度な自己更新性のために研究者によって広く検討され、バイオ人工肝、肝細胞移植、さらには肝組織工学5に理想的なソース細胞を提供する。

現在、肝分化効率は、内胚葉6を充実させることにより大きく高めることができる。幹細胞の内胚葉への系統分化において、変容成長因子β(TGF-β)シグナル伝達およびWNTシグナル伝達経路のレベルは、内胚形成段階のノードにおける重要な因子である。高レベルのTGF-βおよびWNTシグナル伝達の活性化は、endoderm7,8の開発を促進することができる。アクチビンAは、TGF βスーパーファミリーに属するサイトカインである。従って、アクチビンAは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)及びhESC9,10の内胚葉誘導に広く用いられている。GSK3はセリンスレオンニンプロテインキナーゼです。研究者は、GSK3βの特定の阻害剤であるCHIR99021が典型的なWNTシグナルを刺激し、特定の条件下で幹細胞分化を促進できることを発見し、CHIR99021がエンドドーム11、12、13に幹細胞分化を誘導する可能性があることを示唆している。

ここでは、hESCの機能的なHCへの分化を効果的に誘導するための効率的で再現可能な方法を報告します。アクチビンAおよびCHIR99021の順次添加により、約89.7±0.8%SOX17(DEマーカー)陽性細胞が産生された。さらに 質化された細胞は、肝特異的マーカーを発現し、肝細胞様形態(ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)に基づく)およびインドシアニングリーン(ICG)の取り込み、グリコーゲン貯蔵およびCYP3活性の取り込みなどの機能を発揮した。この結果は、hESCがこの方法によって成熟した機能的なHlCに正常に分化され、肝疾患関連の研究と インビトロ 薬物スクリーニングの基礎を提供できることを示している。

Protocol

1. 幹細胞のメンテナンス 注: 以下に説明するセル維持プロトコルは、接着単層で維持される hES03 細胞株に適用されます。この原稿の次のプロトコルすべてについて、細胞は生物学的安全キャビネットの下で扱われるべきである。 5x補充培地をmTesR塩基性培地に希釈して1x mTesR幹細胞培地を調製した。 氷の上に5 mLのDMEM/F12でhESC修飾マトリゲルの5 mLを希釈す?…

Representative Results

hESCからのHLC誘導の概略図と各分化段階の代表的な明視野画像を図1に示す。ステージIでは、殺菌剤AおよびCHIR99021を3日間添加し、幹細胞を誘導して内胚細胞を形成した。ステージIIでは、内胚葉細胞を5日間分化培地で処理した後、肝前駆細胞に分化した。ステージIIIでは、HGFおよびOSMで10日後に初期肝細胞が成熟し、HCに分化していた(図1A)。分化の…

Discussion

ここでは、hESCからHCSを誘導するステップワイズ方式を3段階で提示する。第1段階では、アクティビンAとCHIR99021を使用して、hESCをDEに区別しました。第2段階では、KO-DMEMおよびDMSOを用いて、DEを肝前駆細胞に分化した。第3段階では、HZMプラスHGF、OSMおよびヒドロコルチゾン21-半ミコミネートナトリウム塩を使用して、肝前駆細胞をHLCsに分化し続けた。

プロトコルを使用す…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(81870432第1、X.L.Z.への81570567)(81571994からP.N.S.)によって支えられました。中国広東省自然科学財団(2020A1515010054からP.N.S.)、李嘉誠大学財団(No.L1111 2008からP.N.S.へ。シャントゥ大学医科大学のスタンリー・リン教授に有益なアドバイスをいただき、ありがとうございました。

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

References

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Cite This Article
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

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