فحص خلوي قائم على المراسل لمراقبة كفاءة الربط
Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا لمراسل minigene لمراقبة تأثير طفرات موقع 5′-splice على الربط ويطور مثبط U1 snRNA لإنقاذ تثبيط الربط الناجم عن الطفرة. يتم التعبير عن بنى المراسل والمثبط U1 snRNA في خلايا HeLa ، ويتم تحليل الربط عن طريق تمديد التمهيدي أو RT-PCR.
Abstract
أثناء التعبير الجيني ، تتضمن الخطوة الحيوية لربط ما قبل mRNA التعرف الدقيق على مواقع الربط والتجميع الفعال للمجمعات spliceosomal للانضمام إلى exons وإزالة الإنترونات قبل التصدير السيتوبلازمي للحمض النووي الريبوزي المرسال الناضج. يمكن تغيير كفاءة الربط من خلال وجود طفرات في مواقع الربط ، أو تأثير عوامل الربط المتحولة ، أو نشاط العلاجات. هنا ، نصف بروتوكول الفحص الخلوي الذي يمكن تطبيقه لمراقبة كفاءة الربط لأي إكسون معين. يستخدم الفحص مراسلا بلازميديا قابلا للتكيف مشفرا 3-exon / 2-intron minigene ، والذي يمكن التعبير عنه في خلايا الثدييات عن طريق النقل العابر. بعد النقل ، يتم عزل الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي ، ويتم تحديد كفاءة ربط exon في mRNA المراسل إما عن طريق تمديد التمهيدي أو تفاعل سلسلة النسخ العكسي والبوليميراز شبه الكمي (RT-PCR). نحن نصف كيف يمكن تحديد تأثير الطفرات المرتبطة بالمرض في موقع الربط 5 ′ من خلال تقديمها في المراسل ؛ وكيف يمكن تحقيق قمع هذه الطفرات عن طريق النقل المشترك مع بناء الحمض النووي الريبي النووي الصغير U1 (snRNA) الذي يحمل طفرات تعويضية في منطقته 5 التي تقترن بمواقع ربط 5 عند تقاطعات exon-intron في ما قبل mRNAs. وبالتالي ، يمكن استخدام المراسل لتصميم جزيئات U1 العلاجية لتحسين التعرف على مواقع الربط المتحورة 5 ′. يمكن أيضا استخدام إدراج المواقع التنظيمية التي تعمل على رابطة الدول المستقلة ، مثل محسن الربط أو تسلسل كاتم الصوت ، في المراسل لدراسة دور U1 snRNP في التنظيم بوساطة عامل ربط بديل محدد. وأخيرا، يمكن احتضان الخلايا التي يعبر عنها المراسل بجزيئات صغيرة لتحديد تأثير العلاجات المحتملة على ربط ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال التأسيسي أو على الإكسونات التي تحمل مواقع الربط المتحورة 5 ′. بشكل عام ، يمكن تطبيق فحص المراسل لمراقبة كفاءة الربط في مجموعة متنوعة من الظروف لدراسة آليات الربط الأساسية والأمراض المرتبطة بالربط.
Introduction
يعد ربط ما قبل mRNA خطوة معالجة أساسية تزيل الإنترونات غير المشفرة وتربط بدقة إكسونات الترميز لتشكيل mRNA ناضجة. إن التعرف على تسلسلات الإجماع عند تقاطعات exon-intron ، المشار إليها باسم موقع 5 ′ splice وموقع 3 ′ splice ، بواسطة مكونات آلة الربط يبدأ عملية الربط. يتعرف البروتين الريبي النووي الصغير U1 (snRNP) على موقع الربط 5 ′ عن طريق الاقتران الأساسي للحمض النووي الريبي السري U1 بالحمض النووي الريبي السري (snRNA1) قبل mRNA1. ترتبط الطفرات الموروثة وراثيا التي تغير تسلسل موقع 5′-splice بالعديد من الأمراض2,3. من المتوقع أن يؤدي فقدان الاقتران الأساسي ل U1 snRNA مع مواقع الربط 5 ′ المتحولة إلى ربط شاذ ، مما قد يعرض ترجمة النص المصاب للخطر. يتضمن النهج العلاجي المحتمل لتصحيح عيوب الربط قمع الطفرات بواسطة U1 snRNA المعدل الذي يحمل تغيرات النيوكليوتيدات التعويضية في منطقته 5 التي تتطابق مع موقع الربط 5. وقد وجد أن مثل هذه الحمض النووي الريبوزي المرسال U1 المعدل ، والذي يشار إليه أيضا باسم الحمض النووي الريبوزي المرسال U1 المحدد من exon ، فعال في عكس عيوب الربط ، مما يؤدي إلى زيادة التعبير عن البروتين من mRNA4,5,6,7,8 الذي تم إنقاذه.
هنا ، نصف اختبار تكامل U1 snRNP ، وهو فحص ربط خلوي قائم على المراسل يسمح بتقييم تأثير طفرات 5 ′ ss على ربط exon ويمكن استخدامه أيضا لتطوير U1 snRNAs المعدلة لتمكين إنقاذ تضمين exon. كما نقدم بروتوكولات لمراقبة نصوص المراسل المتسلسل عن طريق تمديد التمهيدي و RT-PCR ، ولتحديد التعبير عن U1 snRNAs المعدلة عن طريق تمديد التمهيدي و RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تكييف الفحص لتحليل الربط في خطوط الخلايا بخلاف HeLa، ومع ذلك، قد تحتاج العوامل التي تؤثر على كفاءة النقل، مثل التقاء الخلايا وكمية الحمض النووي إلى تحسينها. نسبة بناء المراسل إلى U1 هي معلمة حرجة أخرى قد تحتاج إلى تحديدها اعتمادا على مستويات التعبير التي لوحظت في أنواع الخلايا الأخرى. ج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال الأموال المقدمة إلى S.S. من المعاهد الوطنية للصحة (R21CA170786 و R01GM127464) وجمعية السرطان الأمريكية (منحة البحوث المؤسسية 74-001-34-IRG) وإلى S.S. و W.M. من برنامج شراكة أبحاث الوادي (P1-4009 و VRP77). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
