Summary

Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l’impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell’inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

Abstract

Durante l’espressione genica, la fase vitale dello splicing pre-mRNA comporta un riconoscimento accurato dei siti di giunzione e un assemblaggio efficiente di complessi spliceosomiali per unire gli esoni e rimuovere gli introni prima dell’esportazione citoplasmatica dell’mRNA maturo. L’efficienza dello splicing può essere alterata dalla presenza di mutazioni nei siti di giunzione, dall’influenza di fattori di splicing trans-agenti o dall’attività terapeutica. Qui, descriviamo il protocollo per un test cellulare che può essere applicato per monitorare l’efficienza di giunzione di un dato esone. Il test utilizza un reporter minigene plasmidico codificato plasmidico 3-esone/2-introne adattabile, che può essere espresso in cellule di mammifero mediante trasfezione transitoria. Dopo la trasfezione, l’RNA cellulare totale viene isolato e l’efficienza dello splicing dell’esone nell’mRNA reporter è determinata dall’estensione del primer o dalla reazione a catena semi-quantitativa della trascrittasi-polimerasi inversa (RT-PCR). Descriviamo come l’impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′ associate alla malattia può essere determinato introducendole nel reporter; e come la soppressione di queste mutazioni può essere ottenuta mediante co-trasfezione con il piccolo costrutto di RNA nucleare U1 (snRNA) che porta mutazioni compensatorie nella sua regione 5′ che le parti base con i siti di giunzione 5′-giunzione alle giunzioni esone-introne nei pre-mRNA. Pertanto, il reporter può essere utilizzato per la progettazione di particelle U1 terapeutiche per migliorare il riconoscimento dei siti di giunzione 5′ mutanti. L’inserimento di siti regolatori ad azione cis, come il potenziatore di splicing o le sequenze di silenziatori, nel reporter può anche essere utilizzato per esaminare il ruolo dell’U1 snRNP nella regolazione mediata da uno specifico fattore di splicing alternativo. Infine, le cellule che esprimono reporter possono essere incubate con piccole molecole per determinare l’effetto di potenziali terapie sullo splicing costitutivo pre-mRNA o su esoni portatori di siti di giunzione 5′ mutanti. Nel complesso, il test reporter può essere applicato per monitorare l’efficienza dello splicing in una varietà di condizioni per studiare i meccanismi fondamentali di splicing e le malattie associate allo splicing.

Introduction

Lo splicing pre-mRNA è una fase di elaborazione essenziale che rimuove gli introni non codificanti e lega precisamente gli esoni codificanti per formare mRNA maturo. Il riconoscimento delle sequenze di consenso alle giunzioni esone-introne, denominate sito di giunzione 5 e sito di giunzione 3, da parte dei componenti del macchinario di giunzione avvia il processo di giunzione. La piccola ribonucleoproteina nucleare U1 (snRNP) riconosce il sito di giunzione 5 mediante accoppiamento di basi dello snRNA U1 al pre-mRNA1. Le mutazioni geneticamente ereditate che alterano le sequenze del sito di giunzione 5 sono associate a molte malattie2,3. Si prevede che la perdita di basepairing di SnRNA U1 con i siti mutanti di giunzione 5 causi uno splicing aberrante, che può compromettere la traduzione del trascritto interessato. Un potenziale approccio terapeutico per correggere i difetti di splicing comporta la soppressione delle mutazioni da parte di snRNA U1 modificato che trasporta cambiamenti nucleotidici compensatori nella sua regione 5 che le parti base con il sito di giunzione 5. Tali snRNA U1 modificati, noti anche come snRNA U1 specifici dell’esone, sono risultati efficaci nell’invertire i difetti di splicing, con conseguente aumento dell’espressione proteica dall’mRNA salvato4,5,6,7,8.

Qui, descriviamo il test di complementazione U1 snRNP, un test di splicing cellulare basato su reporter che consente di valutare l’effetto delle mutazioni 5-ss sullo splicing di un esone e può anche essere utilizzato per lo sviluppo di snRNA U1 modificati per consentire il salvataggio dell’inclusione di esoni. Forniamo anche protocolli per il monitoraggio delle trascrizioni del reporter spliced tramite estensione primer e RT-PCR e per determinare l’espressione di snRNA U1 modificati mediante estensione primer e RT-qPCR.

Protocol

1. Reagenti e tamponi NOTA: tutta la sterilizzazione con filtri a vuoto deve essere eseguita con membrana di polietersolfone (PES) da 0,2 μm in un armadio di biosicurezza. Preparare acqua priva di RNasi aggiungendo 1,0 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) a 1,0 L di acqua deionizzata, mescolare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (RT), autoclave due volte e quindi raffreddare a RT prima dell’uso. Preparare Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mescolando un pacchetto di …

Representative Results

Il reporter di splicing Dup51, un minigene di tre esoni-due introni, è stato derivato dal gene umano β-globina ed è stato descritto in precedenza (Figura 1A) 11,12 . Abbiamo creato un reporter mutante, Dup51p, introducendo mutazioni del sito di giunzione associate alla sindrome di Usher che si verificano nell’esone 3 del gene protocadherina 15 (PCDH15)13. La sequenza del sito di giunzione 5′-giunzi…

Discussion

Il test può essere adattato per l’analisi di splicing in linee cellulari diverse da HeLa, tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare i fattori che influenzano l’efficienza della trasfezione, come la confluenza cellulare e la quantità di DNA. Il rapporto tra il costruttore reporter e U1 è un altro parametro critico che potrebbe dover essere determinato in base ai livelli di espressione osservati in altri tipi di cellule. La qualità dell’RNA estratto è fondamentale per l’analisi dello splicing; pertanto, l’uso d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi a S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall’American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) e a S.S. e W.M. dal Valley Research Partnership Program (P1-4009 e VRP77). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Materials

Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands – Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

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Cite This Article
Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

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