Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie
Summary
Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5′-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.
Abstract
Tijdens genexpressie omvat de vitale stap van pre-mRNA-splicing nauwkeurige herkenning van spliceplaatsen en efficiënte assemblage van spliceosomale complexen om exonen te verenigen en introns te verwijderen voorafgaand aan cytoplasmatische export van het volwassen mRNA. De splicingefficiëntie kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van mutaties op spliceplaatsen, de invloed van trans-acterende splicingfactoren of de activiteit van therapeutica. Hier beschrijven we het protocol voor een cellulaire assay die kan worden toegepast voor het bewaken van de splicing-efficiëntie van een bepaald exon. De test maakt gebruik van een aanpasbare plasmide gecodeerde 3-exon / 2-intron minigene reporter, die kan worden uitgedrukt in zoogdiercellen door voorbijgaande transfectie. Posttransfectie wordt totaal cellulair RNA geïsoleerd en de efficiëntie van exon splicing in het reporter mRNA wordt bepaald door primer extension of semi-kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We beschrijven hoe de impact van ziekte geassocieerde 5′ splice-site mutaties kan worden bepaald door ze in de reporter te introduceren; en hoe de onderdrukking van deze mutaties kan worden bereikt door co-transfectie met U1 klein nucleair RNA (snRNA) construct met compenserende mutaties in zijn 5 ′-regio die basepairs met de 5′-splice sites op exon-intron juncties in pre-mRNA’s. Zo kan de reporter worden gebruikt voor het ontwerpen van therapeutische U1-deeltjes om de herkenning van mutante 5′splice-sites te verbeteren. Het invoegen van cis-acterende regulerende sites, zoals splicing enhancer of silencer sequences, in de reporter kan ook worden gebruikt om de rol van U1 snRNP in regulatie te onderzoeken, gemedieerd door een specifieke alternatieve splicingfactor. Ten slotte kunnen reporter-expressiecellen worden geïncubeerd met kleine moleculen om het effect van potentiële therapieën op constitutieve pre-mRNA-splicing of op exonen met mutante 5′-spliceplaatsen te bepalen. Over het algemeen kan de reporter-test worden toegepast om de splicing-efficiëntie in verschillende omstandigheden te controleren om fundamentele splicing-mechanismen en splicing-geassocieerde ziekten te bestuderen.
Introduction
Pre-mRNA splicing is een essentiële verwerkingsstap die niet-coderende introns verwijdert en nauwkeurig coderende exonen bindt om volwassen mRNA te vormen. Herkenning van consensussequenties op exon-intron juncties, aangeduid als 5′-splice site en 3′-splice site, door componenten van de splicing machinerie initieert het splicing proces. Het U1 kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) herkent de 5′-splice site door base paring van het U1 snRNA aan het pre-mRNA1. Genetisch overgeërfde mutaties die 5′-splice site sequences veranderen, zijn geassocieerd met vele ziekten2,3. Er wordt voorspeld dat het verlies van basepairing van U1-snRNA met de mutante 5′-splice-sites afwijkende splicing veroorzaakt, wat de vertaling van het aangetaste transcript in gevaar kan brengen. Een mogelijke therapeutische benadering om de splicingdefecten te corrigeren, omvat onderdrukking van mutaties door gemodificeerd U1-snRNA met compenserende nucleotideveranderingen in het 5′-gebied dat basepairs met de 5′-spliceplaats. Dergelijke gemodificeerde U1-snRNA’s, ook wel exonspecifieke U1-snRNA’s genoemd, zijn effectief gebleken bij het omkeren van splicingdefecten, wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie van het geredde mRNA4,5,6,7,8.
Hier beschrijven we de U1 snRNP-complementatietest, een op reporter gebaseerde cellulaire splicing-assay die een beoordeling mogelijk maakt van het effect van 5′-ss-mutaties op splicing van een exon en ook kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van gemodificeerde U1-snRNA’s om de redding van exon-inclusie mogelijk te maken. We bieden ook protocollen voor het monitoren van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie en RT-PCR, en voor het bepalen van de expressie van gemodificeerde U1 snRNA’s door primer extensie en RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
De test kan worden aangepast voor splicinganalyse in andere cellijnen dan HeLa, maar factoren die van invloed zijn op de transfectie-efficiëntie, zoals celconfluentie en hoeveelheid DNA, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd. De reporter-U1-constructverhouding is een andere kritische parameter die mogelijk moet worden bepaald, afhankelijk van de expressieniveaus die in andere celtypen worden waargenomen. De kwaliteit van geëxtraheerd RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse; daarom wordt het gebruik van RNase-v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (de Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) en aan S.S. en W.M. van het Valley Research Partnership Program (P1-4009 en VRP77). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
