Summary

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

Bu protokol, 5′-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Abstract

Gen ekspresyonu sırasında, mRNA öncesi birleştirmenin hayati adımı, olgun mRNA’nın sitoplazmik ihracatından önce eksonları birleştirmek ve intronları çıkarmak için spliceosomal komplekslerin doğru tanınmasını ve spliceosomal komplekslerin verimli bir şekilde birleştirilmesini içerir. Birleştirme verimliliği, splice bölgelerinde mutasyonların varlığı, trans-etkili birleştirme faktörlerinin etkisi veya terapötiklerin aktivitesi ile değiştirilebilir. Burada, herhangi bir eksonun birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilecek hücresel bir test protokolünü açıklıyoruz. Tahlil, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon ile ifade edilebilen uyarlanabilir bir plazmid kodlu 3-exon/2-intron minigene reporter kullanır. Transfeksiyon sonrası, toplam hücresel RNA izole edilir ve muhabir mRNA’daki ekson birleştirmenin verimliliği primer uzatma veya yarı nicel ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenir. 5′ splice-site mutasyonları ile ilişkili hastalığın etkisinin muhabirde tanıtılarak nasıl belirlenebileceğini anlatıyoruz; ve bu mutasyonların bastırılmasının U1 küçük nükleer RNA (snRNA) yapısı ile birlikte transfeksiyon ile nasıl sağlanabileceği, mRNA öncesi bölgelerdeki exon-intron kavşaklarında 5′-splice bölgeleri ile temel alan 5′ bölgesinde telafi edici mutasyonlar taşıyan yapı. Böylece, muhabir mutant 5′ splice-sites tanıma geliştirmek için terapötik U1 parçacıklarının tasarımı için kullanılabilir. Artırıcı veya susturucu dizilerini birleştirme gibi CIS etkili düzenleyici sitelerin muhabire eklenmesi, U1 snRNP’nin belirli bir alternatif birleştirme faktörünün aracılık ettiği düzenlemedeki rolünü incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, hücreleri ifade eden muhabir, potansiyel terapötiklerin konsitutive pre-mRNA birleştirme veya mutant taşıyan eksonlar üzerindeki etkisini belirlemek için küçük moleküllerle inkübe edilebilir 5′ splice siteleri. Genel olarak, muhabir tahlilleri, temel birleştirme mekanizmalarını ve birleştirme ile ilişkili hastalıkları incelemek için çeşitli koşullarda birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilir.

Introduction

Pre-mRNA birleştirme, kodlamayan intronları kaldıran ve olgun mRNA oluşturmak için kodlama eksonlarını hassas bir şekilde lige eden önemli bir işlem adımıdır. Ekson-intron kavşaklarında konsensüs dizilerinin tanınması, 5-splice bölgesi ve 3-splice bölgesi olarak adlandırılır, birleştirme makinelerinin bileşenleri tarafından birleştirme işlemini başlatır. U1 küçük nükleer ribonükleoprotein (snRNP), U1 snRNA’nın mRNA1 öncesi ile baz eşleşmesi ile 5-splice bölgesini tanır. 5-splice bölge dizilerini değiştiren genetik kalıtsal mutasyonlar birçok hastalıkla ilişkilidir2,3. U1 snRNA’nın mutant 5-splice siteleri ile temellenme kaybının, etkilenen transkriptin çevirisini tehlikeye atabilecek sapkın birleştirmeye neden olduğu öngörülebilir. Birleştirme kusurlarını düzeltmek için potansiyel bir terapötik yaklaşım, 5′splice bölgesi ile temel alan 5-bölgesinde telafi edici nükleotid değişiklikleri taşıyan modifiye U1 snRNA tarafından mutasyonların bastırılmasını içerir. Ekson spesifik U1 snRNA’ları olarak da adlandırılan bu tür modifiye U1 snRNA’larının, ekstifleme kusurlarının tersine çevrilmesinde etkili olduğu ve kurtarılan mRNA4,5,6,7,8’den protein ekspresyonunda artışa neden olduğu bulunmuştur.

Burada, U1 snRNP tamamlama testini, 5-ss mutasyonunun bir ekzonun bir eklenmesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin veren ve ayrıca akson dahil etmenin kurtarılmasını sağlamak için değiştirilmiş U1 snRNA’larının geliştirilmesi için de kullanılabilen muhabir tabanlı bir hücresel birleştirme tahlili olarak tanımlıyoruz. Ayrıca, bir aradaki muhabir transkriptlerinin primer uzantısı ve RT-PCR ile izlenmesi ve değiştirilmiş U1 snRNA’ların primer uzantısı ve RT-qPCR ile ifadesinin belirlenmesi için protokoller sunuyoruz.

Protocol

1. Reaktifler ve tamponlar NOT: Vakum filtreleri kullanılarak yapılan tüm sterilizasyonlar biyogüvenlik kabininde 0,2 μm polietrülfon (PES) membran ile yapılmalıdır. 1,0 L deiyonize suya 1,0 mL dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyerek RNase içermeyen su hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat karıştırın, iki kez otoklavlayın ve kullanmadan önce RT’ye soğutun. Bir paket DMEM tozu (13,4 g), 3,7 g sodyum bikarbonat, 100 mL fetal sığır serumu (FBS), …

Representative Results

Üç ekson-iki intron minigene olan birleştirme muhabiri Dup51, insan β-globin geninden türetilmiştir ve daha önce tanımlanmıştır (Şekil 1A)11,12 . Protocadherin 15 (PCDH15) geni13’ün ekson 3’lüğünde meydana gelen Usher sendromu ilişkili 5′-splice bölgesi mutasyonlarını tanıtarak dup51p adlı bir mutant muhabir oluşturduk. Ekson 2-intron 2 kavşağında 5′-splice site dizisi CAG/GU…

Discussion

Test, HeLa dışındaki hücre hatlarında birleştirme analizi için uyarlanabilir, ancak hücre konflüensi ve DNA miktarı gibi transeksiyon verimliliğini etkileyen faktörlerin optimize edilmesi gerekebilir. Muhabirden U1 yapı oranına, diğer hücre türlerinde gözlenen ifade düzeylerine bağlı olarak belirlenmesi gerekebilecek başka bir kritik parametredir. Çıkarılan RNA’nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir; bu nedenle, RNaz içermeyen su kullanımı ve RNase inaktivasyon ajanlar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği’nden (Kurumsal Araştırma Hibesi 74-001-34-IRG) ve Vadi Araştırma Ortaklığı Programı’ndan (P1-4009 ve VRP77) S.S. ve W.M.’ye fonlarla desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Materials

Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands – Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

References

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Play Video

Cite This Article
Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

View Video