عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير
Summary
تفرز البكتيريا حويصلات خارج الخلية بحجم النانومتر (EVs) تحمل جزيئات بيولوجية نشطة بيولوجيا. تركز أبحاث EV على فهم تكوينها الحيوي ، ودورها في تفاعلات الميكروب والميكروب والميكروب المضيف والمرض ، بالإضافة إلى تطبيقاتها العلاجية المحتملة. يتم تقديم سير عمل للعزل القابل للتطوير للمركبات الكهربائية من البكتيريا المختلفة لتسهيل توحيد أبحاث المركبات الكهربائية.
Abstract
تفرز الأنواع البكتيرية المتنوعة ~ 20-300 نانومتر حويصلات خارج الخلية (EVs) ، تتكون من الدهون والبروتينات والأحماض النووية والجليكان والجزيئات الأخرى المشتقة من الخلايا الأبوية. تعمل المركبات الكهربائية كناقلات اتصال داخل الأنواع وفيما بينها بينما تساهم أيضا في التفاعل بين البكتيريا والكائنات المضيفة في سياق العدوى والاستعمار. نظرا للعديد من الوظائف المنسوبة إلى EVs في الصحة والمرض ، هناك اهتمام متزايد بعزل EVs للدراسات في المختبر وفي الجسم الحي . تم افتراض أن فصل المركبات الكهربائية على أساس الخصائص الفيزيائية ، أي الحجم ، من شأنه أن يسهل عزل الحويصلات من الثقافات البكتيرية المتنوعة.
يتكون سير عمل العزل من الطرد المركزي والترشيح والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لعزل المركبات الكهربائية عن الثقافات البكتيرية. تم دمج خطوة ترشيح التدفق العرضي (TFF) التي تعمل بالمضخة لتعزيز قابلية التوسع ، مما يتيح عزل المواد من لترات زراعة الخلايا الأولية. تم استخدام الإشريكية القولونية كنظام نموذجي يعبر عن نانولوسيفيراز المرتبط ب EV و mCherry غير المرتبط ب EV كبروتينات مراسلة. تم استهداف nanoluciferase إلى EVs عن طريق دمج نهايته N مع cytolysin A. كانت كسور الكروماتوغرافيا المبكرة التي تحتوي على 20-100 نانومتر EVs مع السيتوليسين A – nanoLuc المرتبط بها متميزة عن الكسور اللاحقة التي تحتوي على البروتينات الحرة. تم تأكيد وجود نانولوسيفيراز المرتبط ب EV من خلال وضع العلامات المناعية والمجهر الإلكتروني المرسل. ينطبق سير عمل عزل EV هذا على الأنواع البكتيرية الأخرى سالبة الجرام وإيجابية الجرام المرتبطة بالأمعاء البشرية. في الختام ، يتيح الجمع بين الطرد المركزي والترشيح والترشيح الفائق / TFF و SEC عزلا قابلا للتطوير للمركبات الكهربائية من الأنواع البكتيرية المتنوعة. سيؤدي استخدام سير عمل عزل موحد إلى تسهيل الدراسات المقارنة للمركبات الكهربائية الميكروبية عبر الأنواع.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل تشبه الجسيمات الشحمية بحجم النانومتر تتكون من الليبيدات والبروتينات والجليكان والأحماض النووية ، تفرزها كل من الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة1. منذ الدراسات المبكرة التي تصور إطلاق EVs من البكتيريا سالبة الجرام2 ، كان عدد الوظائف البيولوجية المنسوبة إلى EVs البكتيرية (قطرها 20-300 نانومتر) ينمو باستمرار في العقود الماضية. وتشمل وظائفها نقل مقاومة المضادات الحيوية3 ، وتشكيل الأغشية الحيوية4 ، واستشعار النصاب5 ، وتوصيل السموم6. هناك أيضا اهتمام متزايد باستخدام المركبات الكهربائية البكتيرية كعلاجات ، خاصة في علم اللقاحات7 وعلاج السرطان8.
على الرغم من الاهتمام المتزايد بأبحاث المركبات الكهربائية ، لا تزال هناك تحديات تقنية فيما يتعلق بطرق العزل. على وجه التحديد ، هناك حاجة إلى طرق عزل قابلة للتكرار وقابلة للتطوير ومتوافقة مع الكائنات الحية المتنوعة المنتجة للمركبات الكهربائية. لإنشاء مجموعة موحدة من المبادئ لتخطيط والإبلاغ عن عزل EV وطرق البحث ، تقوم الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية بنشر وتحديث ورقة موقف MISEV9. علاوة على ذلك ، يوفر اتحاد EV-TRACK منصة مفتوحة للإبلاغ عن المنهجيات التفصيلية لعزل EV المستخدمة في المخطوطات المنشورة لتعزيز الشفافية10.
في هذا البروتوكول ، تم تكييف المنهجيات السابقة المستخدمة لعزل EVs من زراعة خلايا الثدييات11,12 لتمكين عزل EVs من زراعة الخلايا البكتيرية. سعينا إلى استخدام الأساليب التي تمكن من عزل EV من مجموعة متنوعة من الميكروبات ، والتي يمكن أن تكون قابلة للتطوير ، وتحقيق التوازن بين نقاء EV والعائد (كما تمت مناقشته في ورقة موقف MISEV9). بعد إزالة الخلايا البكتيرية والحطام عن طريق الطرد المركزي والترشيح ، يتركز وسط الاستزراع إما عن طريق الترشيح الفائق لجهاز الطرد المركزي (لحجم يصل إلى ~ 100 مل) أو TFF الذي يحركه المضخة (للأحجام الأكبر). ثم يتم عزل المركبات الكهربائية بواسطة SEC باستخدام أعمدة محسنة لتنقية المركبات الكهربائية الصغيرة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على سير عمل عزل EV البكتيري. الاختصارات: EV = حويصلة خارج الخلية ؛ TFF = ترشيح التدفق العرضي ؛ SEC = كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ؛ MWCO = قطع الوزن الجزيئي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تم استخدام سلالة فأر كومنسال من Escherichia coli (أي E. coli MP113) ككائن نموذجي وتم تعديلها للتعبير عن نانولوسيفيراز المرتبط ب EV عن طريق الاندماج مع cytolysin A ، كما ورد سابقا14. يمكن للطرق المستخدمة هنا معالجة ما يصل إلى عدة لترات على الأقل من الثقافات البكتيرية وفصل البروتينات المرتبطة ب EV عن البروتينات غير المرتبطة ب EV بشكل فعال. أخيرا ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للأنواع البكتيرية الأخرى إيجابية الجرام وسالبة الجرام. تم تقديم جميع البيانات ذات الصلة بالتجارب المبلغ عنها إلى قاعدة معارف EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول أعلاه ، يتم وصف طريقة قابلة للتطوير وتعزل المركبات الكهربائية بشكل موثوق من مختلف البكتيريا سالبة الجرام / الإيجابية والهوائية / اللاهوائية. لديها العديد من نقاط التوقف المحتملة طوال الإجراء ، على الرغم من أنه من الأفضل تجنب أخذ أكثر من 48 ساعة لعزل المركبات الكهربائية عن وسا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث الموصوف أعلاه من خلال منحة تدريب NIH TL1 TR002549-03. نشكر الدكتور جون سي تيلتون وزاكاري تروير (جامعة كيس ويسترن ريزيرف) لتسهيل الوصول إلى أداة تحليل حجم الجسيمات. Lew Brown (Spectradyne) للمساعدة التقنية في تحليل بيانات توزيع حجم الجسيمات ؛ الدكتور ديفيد بوتنام في جامعة كورنيل لتوفير البلازميد pClyA-GFP14 ؛ والدكتور مارك جوليان من جامعة بنسلفانيا لتزويدنا ب E. coli MP113.
Materials
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6×500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
- Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
- Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
- Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
- Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -. T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
- Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
- Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
- Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
- Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).
