Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias
Summary
Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.
Abstract
Diversas especies bacterianas secretan ~20-300 nm vesículas extracelulares (EV), compuestas de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos y otras moléculas derivadas de las células parentales. Los EV funcionan como vectores de comunicación dentro y entre especies, al tiempo que contribuyen a la interacción entre bacterias y organismos huéspedes en el contexto de la infección y la colonización. Dada la multitud de funciones atribuidas a los EV en la salud y la enfermedad, existe un creciente interés en aislar los EV para estudios in vitro e in vivo . Se planteó la hipótesis de que la separación de EV basada en propiedades físicas, es decir, tamaño, facilitaría el aislamiento de vesículas de diversos cultivos bacterianos.
El flujo de trabajo de aislamiento consiste en centrifugación, filtración, ultrafiltración y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para el aislamiento de EV de cultivos bacterianos. Se incorporó un paso de filtración de flujo tangencial (TFF) impulsado por bomba para mejorar la escalabilidad, lo que permite el aislamiento del material de los litros de cultivo celular inicial. Escherichia coli se utilizó como un sistema modelo que expresa nanoluciferasa asociada a EV y mCherry no asociada a EV como proteínas reporteras. La nanoluciferasa se dirigió a los EV fusionando su N-terminal con citolisina A. Las fracciones de cromatografía tempranas que contenían EV de 20-100 nm con citolisina A – nanoLuc asociadas eran distintas de las fracciones posteriores que contenían las proteínas libres. La presencia de nanoluciferasa asociada a EV se confirmó mediante etiquetado de inmunooro y microscopía electrónica de transmisión. Este flujo de trabajo de aislamiento EV es aplicable a otras especies bacterianas gramnegativas y grampositivas asociadas al intestino humano. En conclusión, la combinación de centrifugación, filtración, ultrafiltración / TFF y SEC permite el aislamiento escalable de EV de diversas especies bacterianas. El empleo de un flujo de trabajo de aislamiento estandarizado facilitará los estudios comparativos de EV microbianos entre especies.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras similares a liposomas de tamaño nanométrico compuestas de lípidos, proteínas, glicanos y ácidos nucleicos, secretados por células procariotas y eucariotas1. Desde los primeros estudios que visualizan la liberación de EV de bacterias gramnegativas2, el número de funciones biológicas atribuidas a las EV bacterianas (20-300 nm de diámetro) ha estado creciendo constantemente en las últimas décadas. Sus funciones incluyen la transferencia de resistencia a los antibióticos3, la formación de biopelículas4, la detección de quórum5 y la administración de toxinas6. También hay un creciente interés en el uso de EV bacterianas como terapéutica, especialmente en vacunología7 y terapia contra el cáncer8.
A pesar del creciente interés en la investigación de vehículos eléctricos, todavía existen desafíos técnicos con respecto a los métodos de aislamiento. Específicamente, existe la necesidad de métodos de aislamiento que sean reproducibles, escalables y compatibles con diversos organismos productores de EV. Para crear un conjunto unificado de principios para planificar y reportar el aislamiento de EV y los métodos de investigación, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares publica y actualiza el documento de posición MISEV9. Además, el consorcio EV-TRACK proporciona una plataforma abierta para informar metodologías detalladas para el aislamiento de EV utilizadas en manuscritos publicados para mejorar la transparencia10.
En este protocolo, se adaptaron metodologías previas utilizadas para el aislamiento de EVs a partir de cultivos celulares de mamíferos11,12 para permitir el aislamiento de EVs a partir de cultivo celular bacteriano. Buscamos emplear métodos que permitan el aislamiento de EV de una variedad de microbios, que pueden ser escalables, y equilibrar la pureza y el rendimiento de EV (como se discutió en el documento de posición9 de MISEV). Después de eliminar las células bacterianas y los desechos por centrifugación y filtración, el medio de cultivo se concentra mediante ultrafiltración del dispositivo centrífugo (para un volumen de hasta ~ 100 ml) o TFF accionado por bomba (para volúmenes más grandes). Los vehículos eléctricos son aislados por SEC utilizando columnas optimizadas para la purificación de pequeños vehículos eléctricos.
Figura 1: Descripción general del esquema del flujo de trabajo de aislamiento de EV bacteriano. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TFF = filtración de flujo tangencial; SEC = cromatografía de exclusión de tamaño; MWCO = corte de peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una cepa comensal de ratón de Escherichia coli (es decir, E. coli MP113) fue utilizada como organismo modelo y modificada para expresar nanoluciferasa asociada a EV por fusión a citolisina A, como se informó anteriormente14. Los métodos utilizados aquí pueden procesar al menos hasta varios litros de cultivos bacterianos y separar eficazmente las proteínas asociadas a EV de las no asociadas a EV. Finalmente, este método también se puede utilizar para otras especies bacterianas grampositivas y gramnegativas. Todos los datos relevantes de los experimentos reportados se enviaron a la base de conocimiento EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el protocolo anterior, se describe un método que es escalable y aísla de manera confiable los EV de varias bacterias gramnegativas / positivas y aeróbicas / anaeróbicas. Tiene varios puntos de parada potenciales a lo largo del procedimiento, aunque es mejor evitar tomar más de 48 h para aislar los EV de los medios de cultivo bacteriano condicionados.
En primer lugar, consiste en cultivar bacterias para generar un medio de cultivo bacteriano condicionado. Se encontró que aumentar el ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación descrita anteriormente fue apoyada por la subvención de capacitación NIH TL1 TR002549-03. Agradecemos a los doctores John C. Tilton y Zachary Troyer (Case Western Reserve University) por facilitar el acceso al instrumento analizador de tamaño de partículas; Lew Brown (Spectradyne) por su asistencia técnica con el análisis de los datos de distribución del tamaño de partícula; el Dr. David Putnam de la Universidad de Cornell por proporcionar el plásmido14 pClyA-GFP; y el Dr. Mark Goulian de la Universidad de Pensilvania por proporcionarnos la E. coli MP113.
Materials
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6×500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
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