توصيل miRNA الخارجي المركب صناعيا إلى الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى
Summary
هنا ، نقدم محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا إلى الكلى عن طريق حقن الوريد الخلفي لناقل غير فيروسي وجسيمات نانوية بولي إيثيلينيمين في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى. أدى ذلك إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNA المستهدف في الكلى ، مما أدى إلى تثبيط تطور مرض الكلى في العديد من نماذج الفئران.
Abstract
الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرار وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة. لذلك ، فإن تناوب تعبير miRNA عن طريق محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار علاجي مفيد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى. ومع ذلك ، نظرا لأن الحمض النووي الريبي في المصل يتحلل على الفور من محاكاة miRNA الخارجية التي يتم تناولها بشكل منهجي في الجسم الحي ، فإن توصيل miRNA إلى الكلى لا يزال يمثل تحديا. لذلك ، فإن النواقل التي يمكن أن تحمي محاكاة miRNA الخارجية من التدهور بواسطة RNAase وتوصيلها بشكل كبير إلى الكلى ضرورية. استخدمت العديد من الدراسات النواقل الفيروسية لتوصيل محاكيات أو مثبطات miRNA الخارجية إلى الكلى. ومع ذلك ، قد تسبب النواقل الفيروسية استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني. لذلك ، فإن تطوير النواقل الفيروسية هو أيضا عقبة أمام الاستخدام السريري لمحاكاة أو مثبطات miRNA الخارجية. للتغلب على هذه المخاوف المتعلقة بالنواقل الفيروسية ، قمنا بتطوير طريقة ناقل غير فيروسي لتوصيل محاكاة miRNA إلى الكلى باستخدام حقن الوريد الذيلي لجسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، مما أدى إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNAs المستهدفة في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى.
Introduction
miRNAs ، الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (21-25 قاعدة) التي لا تترجم إلى بروتينات ، تمنع الكثير من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرارها وتثبيط ترجمتها في أمراض الكلى المختلفة 1,2. لذلك ، فإن العلاج الجيني الذي يستخدم مقلدات أو مثبطات miRNA الخارجية المركبة صناعيا هو خيار جديد محتمل لتثبيط تطور العديد من أمراض الكلى3،4،5.
على الرغم من الوعد بمحاكاة أو مثبطات miRNA للعلاج الجيني ، إلا أن توصيله إلى الأعضاء المستهدفة لا يزال يمثل عقبة كبيرة أمام التجارب في الجسم الحي لتطوير إمكاناتها السريرية. نظرا لأن محاكيات أو مثبطات miRNA المركبة صناعيا تخضع للتدهور الفوري بواسطة مصل RNase ، يتم تقصير عمر النصف عند الإدارة الجهازية في الجسم الحي6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كفاءة miRNA تحاكي أو مثبطات عبور غشاء البلازما والسيتوبلازم المنقول بشكل عام أقل بكثير بدون ناقلات مناسبة 7,8. تشير خطوط الأدلة هذه إلى أن تطوير نظام توصيل miRNA يحاكي أو مثبطات الكلى مطلوب ، لتمكين استخدامها في الإعدادات السريرية وجعلها خيارا علاجيا جديدا للمرضى الذين يعانون من أمراض الكلى المختلفة.
تم استخدام النواقل الفيروسية كناقلات لتوصيل محاكيات miRNA الخارجية أو مثبطات إلى الكلى 9,10. على الرغم من أنها قد تم تطويرها من أجل السلامة الأحيائية وفعالية النقل ، إلا أن النواقل الفيروسية قد تسبب استجابة للإنترفيرون و / أو عدم الاستقرار الجيني11,12. للتغلب على هذه المخاوف ، قمنا بتطوير miRNA يحاكي نظام توصيل الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلين النانوية (PEI-NPs) ، وهو ناقل غير فيروسي ، في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى13،14،15.
PEI-NPs هي NPs خطية قائمة على البوليمر يمكنها توصيل قليل النيوكليوتيدات بشكل فعال ، بما في ذلك محاكاة miRNA ، إلى الكلى ، وتعتبر مفضلة لإعداد النواقل غير الفيروسية بسبب سلامتها على المدى الطويل وتوافقها الحيوي13،16،17.
توضح هذه الدراسة آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عن طريق حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية للتليف الكلوي التي ينتجها انسداد الحالب أحادي الجانب (UUO). بالإضافة إلى ذلك ، نوضح آثار محاكاة miRNA الخارجية المنهجية للتوصيل باستخدام PEI-NPs عبر حقن الوريد الذيل في الفئران النموذجية لمرض الكلى السكري (الفئران db / db: C57BLBS / J Iar – + Leprdb / + Leprdb) والفئران النموذجية لإصابة الكلى الحادة التي تنتجها إصابة نقص التروية الكلوية (IRI).
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة ، يمكن ل PEI-NPs توصيل محاكاة miRNA إلى الكلى للحث على الإفراط في التعبير عن miRNAs المستهدفة ، مما يؤدي إلى تأثيرات علاجية في نماذج الفئران في الجسم الحي للعديد من أمراض الكلى ، بما في ذلك التليف الكلوي ومرض الكلى السكري و AKI.
طريقة تحض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI (المنحة رقم 21K08233). نشكر Edanz (https://jp.edanz.com/ac) على تحرير مسودات هذه المخطوطة.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
