Livraison d’un miARN exogène synthétisé artificiellement dans le rein à l’aide de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale
Summary
Ici, nous livrons des imitations exogènes de miARN synthétisées artificiellement au rein via l’injection veineuse d’un vecteur non viral et de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale. Cela a conduit à une surexpression significative de miARN cible dans le rein, entraînant une progression inhibée de la maladie rénale dans plusieurs modèles murins.
Abstract
Les microARN (miARN), petits ARN non codants (21-25 bases) qui ne sont pas traduits en protéines, inhibent beaucoup d’ARN messagers cibles (ARNm) en déstabilisant et en inhibant leur traduction dans diverses maladies rénales. Par conséquent, l’alternance de l’expression des miARN par des imitations exogènes de miARN synthétisées artificiellement est une option de traitement potentiellement utile pour inhiber le développement de nombreuses maladies rénales. Cependant, étant donné que l’ARNase sérique dégrade immédiatement les imitations de miARN exogènes systématiquement administrées in vivo, l’administration de miARN au rein reste un défi. Par conséquent, des vecteurs capables de protéger les imitations exogènes des miARN de la dégradation par l’ARNase et de les délivrer de manière significative au rein sont nécessaires. De nombreuses études ont utilisé des vecteurs viraux pour délivrer des imitations ou des inhibiteurs exogènes de miARN au rein. Cependant, les vecteurs viraux peuvent provoquer une réponse à l’interféron et/ou une instabilité génétique. Par conséquent, le développement de vecteurs viraux est également un obstacle à l’utilisation clinique d’imitations ou d’inhibiteurs exogènes des miARN. Pour surmonter ces préoccupations concernant les vecteurs viraux, nous avons développé une méthode de vecteur non viral pour délivrer des imitations de miARN au rein en utilisant l’injection veineuse de la queue de nanoparticules de polyéthylène (PEI-NP), ce qui a conduit à une surexpression significative des miARN cibles dans plusieurs modèles murins de maladie rénale.
Introduction
Les miARN, petits ARN non codants (21-25 bases) qui ne sont pas traduits en protéines, inhibent beaucoup d’ARN messagers cibles (ARNm) en les déstabilisant et en inhibant leur traduction dans diverses maladies rénales 1,2. Par conséquent, la thérapie génique utilisant des imitations ou des inhibiteurs exogènes de miARN synthétisés artificiellement est une nouvelle option potentielle pour inhiber le développement de nombreuses maladies rénales 3,4,5.
Malgré la promesse de mi-ARN imitateurs ou inhibiteurs pour la thérapie génique, l’administration aux organes cibles reste un obstacle majeur pour les expériences in vivo afin de développer leur potentiel clinique. Étant donné que les mi-ARN synthétisés artificiellement ou les inhibiteurs sont soumis à une dégradation immédiate par la RNase sérique, leur demi-vie est raccourcie lors de l’administration systémique in vivo6. De plus, l’efficacité des imitations ou inhibiteurs des miARN pour traverser la membrane plasmique et transfecter le cytoplasme est généralement beaucoup plus faible sans vecteurs appropriés 7,8. Ces sources de données suggèrent que le développement du système d’administration de miARN imite ou inhibiteur pour le rein est nécessaire, afin de permettre leur utilisation en milieu clinique et d’en faire une nouvelle option de traitement pour les patients atteints de diverses maladies rénales.
Des vecteurs viraux ont été utilisés comme vecteurs pour délivrer des imitations ou des inhibiteurs exogènes des miARN au rein 9,10. Bien qu’ils aient été développés pour la biosécurité et l’efficacité de la transfection, les vecteurs viraux peuvent encore provoquer une réponse à l’interféron et/ou une instabilité génétique11,12. Pour surmonter ces préoccupations, nous avons développé un système d’administration miARN imitant le rein en utilisant des nanoparticules de polyéthylènemine (PEI-NPs), un vecteur non viral, dans plusieurs modèles murins de maladie rénale13,14,15.
Les PEI-NP sont des NP linéaires à base de polymères qui peuvent délivrer efficacement des oligonucléotides, y compris des imitateurs de miARN, dans les reins, et sont considérés comme préférables pour la préparation de vecteurs non viraux en raison de leur innocuité et de leur biocompatibilité à long terme13,16,17.
Cette étude démontre les effets de l’administration systématique de miARN exogène imitant l’administration avec les IPE-NP par injection veineuse de la queue chez des souris modèles de fibrose rénale produites par obstruction unilatérale de l’uretère (UUO). De plus, nous démontrons les effets de l’administration systématique de miARN exogènes avec les IPE-NP par injection veineuse de la queue chez des souris modèles d’insuffisance rénale diabétique (souris db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) et des souris modèles de lésions rénales aiguës produites par une lésion d’ischémie-reperfusion rénale (IRI).
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les IPE-IP peuvent délivrer des imitations de miARN au rein pour induire une surexpression des miARN cibles, ce qui entraîne des effets de traitement dans des modèles murins in vivo de plusieurs maladies rénales, y compris la fibrose rénale, l’insuffisance rénale diabétique et l’IRA.
La méthode de préparation du complexe de PEI-NPs et miARN mimic est très simple. La surface chargée positivement des PEI-NPs piège l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI (subvention n° 21K08233). Nous remercions Edanz (https://jp.edanz.com/ac) d’avoir édité les brouillons de ce manuscrit.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
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