Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA’nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.
mikroRNA’lar (miRNA’lar), proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA’lar (21-25 baz), çeşitli böbrek hastalıklarında dengelerini bozarak ve translasyonlarını inhibe ederek birçok hedef mesajcı RNA’yı (mRNA) inhibe eder. Bu nedenle, miRNA ekspresyonunun eksojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri ile değiştirilmesi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel olarak yararlı bir tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, serum RNAaz, sistematik olarak uygulanan eksojen miRNA taklitlerini in vivo olarak derhal bozduğundan, miRNA’nın böbreğe verilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, eksojen miRNA taklitlerini RNAaz tarafından bozulmaya karşı koruyabilen ve bunları böbreğe önemli ölçüde iletebilen vektörler gereklidir. Birçok çalışma, böbreğe eksojen miRNA taklitleri veya inhibitörleri vermek için viral vektörler kullanmıştır. Bununla birlikte, viral vektörler interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilir. Bu nedenle, viral vektörlerin gelişimi, eksojen miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin klinik kullanımı için de bir engeldir. Viral vektörlerle ilgili bu endişelerin üstesinden gelmek için, polietilenimin nanopartiküllerinin (PEI-NP’ler) kuyruk damarı enjeksiyonunu kullanarak böbreğe miRNA taklitleri vermek için viral olmayan bir vektör yöntemi geliştirdik, bu da böbrek hastalığının birkaç fare modelinde hedef miRNA’ların önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı.
miRNA’lar, proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA’lar (21-25 baz), birçok hedef mesajcı RNA’yı (mRNA’lar) istikrarsızlaştırarak ve çeşitli böbrek hastalıklarında translasyonlarını inhibe ederek inhibe eder 1,2. Bu nedenle, ekzojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri veya inhibitörleri kullanan gen tedavisi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel yeni bir seçenektir 3,4,5.
Gen terapisi için miRNA taklitleri veya inhibitörlerinin vaadine rağmen, hedef organlara teslimat, in vivo deneylerin klinik potansiyellerini geliştirmeleri için büyük bir engel olmaya devam etmektedir. Yapay olarak sentezlenen miRNA taklitleri veya inhibitörleri serum RNaz tarafından derhal bozunmaya maruz kaldıklarından, in vivo6 sistemik uygulama üzerine yarı ömürleri kısalır. Ek olarak, miRNA taklitçilerinin veya inhibitörlerinin plazma zarını ve transfektan sitoplazmasını geçme etkinliği genellikle uygun vektörler olmadan çok daha düşüktür 7,8. Bu kanıtlar, böbrek için miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin dağıtım sisteminin geliştirilmesinin, klinik ortamlarda kullanımlarını sağlamak ve çeşitli böbrek hastalıkları olan hastalar için yeni bir tedavi seçeneği haline getirmek için gerekli olduğunu göstermektedir.
Viral vektörler, eksojen miRNA taklitlerini veya inhibitörlerini böbreğe iletmek için taşıyıcı olarak kullanılmıştır 9,10. Biyogüvenlik ve transfeksiyon etkinliği için geliştirilmiş olmalarına rağmen, viral vektörler hala interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilirler11,12. Bu endişelerin üstesinden gelmek için, böbrek hastalığının birkaç fare modelinde viral olmayan bir vektör olan polietilenimin nanopartiküllerini (PEI-NP’ler) kullanarak böbrek için bir miRNA taklit dağıtım sistemi geliştirdik13,14,15.
PEI-NP’ler, miRNA taklitleri de dahil olmak üzere oligonükleotidleri böbreğe etkili bir şekilde iletebilen doğrusal polimer bazlı NP’lerdir ve uzun vadeli güvenlikleri ve biyouyumlulukları nedeniyle viral olmayan vektörlerin hazırlanmasında tercih edilir13,16,17.
Bu çalışma, tek taraflı üreter obstrüksiyonu (UUO) ile üretilen renal fibrozis model farelerde kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla PEI-NP’lerle sistematik eksojen miRNA taklitçiliğinin etkilerini göstermektedir. Ek olarak, diyabetik böbrek hastalığı model farelerde (db/db fareler: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) ve renal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) tarafından üretilen akut böbrek hasarı model farelerde kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP’lerle sistematik ekzojen miRNA mimik verilmesinin etkilerini gösterdik.
Bu makalede sunulan protokolü kullanarak, PEI-NP’ler, hedef miRNA’ların aşırı ekspresyonunu indüklemek için böbreğe miRNA taklitleri verebilir ve bu da renal fibroz, diyabetik böbrek hastalığı ve AKI dahil olmak üzere çeşitli böbrek hastalıklarının in vivo fare modellerinde tedavi etkilerine neden olabilir.
PEI-NP kompleksini ve miRNA taklidini hazırlama yöntemi çok basittir. PEI-NP’lerin pozitif yüklü yüzeyi, 13,14,15,16,17 karıştırıldığında miRNA tak…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI (Hibe No. 21K08233) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının taslaklarını düzenlediği için Edanza’ya (https://jp.edanz.com/ac) teşekkür ederiz.
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |